功能模块的集成与测试研究

谷氨酸棒杆菌作为棒杆菌中的模式生物,拥有多条完整的芳香化合物代谢途径,全基因组测序的完成为在谷氨酸棒杆菌中进行代谢调控研究提供了良好的生物信息学平台;该菌包括基因敲除及互补在内的遗传操作系统非常成熟,是研究芳香化合物代谢调控机制的良好模型。该研究旨在利用棒杆菌等模式生物中的莽草酸合成及芳香化合物代谢相关元件进行元件适配性研究,同时结合生物信息学、分子生物学及生物化学方法发掘其他微生物中这两类元件,并对元件进行表征、改造及标准化并建立元件库;选取高效能的功能元件拼接组装为功能模块,并在棒杆菌等底盘细胞中进行检测适配性,从而构建出高效合成以莽草酸为代表性芳香化合物的人工细胞。到目前为止,研究工作完成了谷氨酸棒杆菌莽草酸合成途径酶元件的鉴定,重点完成了谷棒DAHP合酶和分支酸异构酶功能表征及元件间适配性关系,获得大量潜在的莽草酸合成相关代谢元件;并对部分代谢元件进行功能验证和表征;同时建立高效蛋白表达及酶活测定体系。鉴定了谷棒莽草酸途径的7个酶以及分支酸异构酶,完成了谷棒DAHP合酶、分支酸异构酶、脱氢奎尼酸脱水酶以及莽草酸激酶功能表征,揭示了DAHP合酶和分支酸异构酶相互作用机理和调控关系。获得了3 549个莽草酸途径相关基因序列,确定了516个合成目标基因,完成了这些基因密码子优化和基因序列重新设计,选取了37个脱氢奎尼酸脱水酶基因人工合成,构建标准元件库,并表征了它们的酶促动力学参数。构建并验证了快速高通量的筛选—优化—合成—表征莽草酸途径元件库的Pipeline。另外在调控元件库构建方面,构建了包括RBS、Promoter、Terminator以及Insulator等4类共226个元件的调控元件库,为莽草酸通路模块的优化和精细调控的奠定了基础。模块的组装和优化方面,构建了基于Ribo J Insulator的基因表达定量调控模型,合成了莽草酸本地途径酶元件和调控元件元件进行模块组装,并在底盘细胞谷氨酸棒杆菌中实现了表达,对最优配比进行了初步筛选,将莽草酸产量提高了7倍。     

包囊游仆虫休眠细胞中大核和线粒体DNA的多态性

为了探索纤毛虫休眠细胞中两套遗传系统的作用特征,对包囊游仆虫（Euplotes encysticus）休眠细胞与营养细胞大核DNA和线粒体DNA进行了RAPD比较.结果显示,在所选用的35条随机引物中,包囊游仆虫大核DNA共扩增出220条片段,其中以休眠细胞大核DNA为模板扩增出18条特有片段,以营养细胞大核DNA为模板扩增出44条特有片段,两者存在28%的差异.在所选用的32条随机引物中,线粒体DNA共扩增出154条片段,其中以休眠细胞线粒体DNA为模板扩增出19条特有片段,以营养细胞线粒体DNA为模板扩增出25条特有片段,两者有29%的差异.这些结果表明,包囊游仆虫休眠细胞与营养细胞的大核DNA结构存着一定的差异;两者的线粒体DNA结构也存在差异.因此,包囊游仆虫在休眠细胞形成过程中,大核DNA、线粒体DNA结构可能都发生了一定的变化,并且这些变化可能与休眠细胞形成过程中的形态结构和代谢活动等剧烈变化以及休眠状态下的生理生化变化密切相关.所得结果为揭示纤毛虫细胞结构的分化与细胞遗传物质的作用关系提供了基础资料.     

二异丙氧基磷酰化亮赖叉肽甲酯诱导K562细胞凋亡

为寻找能特异性诱导肿瘤细胞凋亡的小分子诱导剂,研究了二异丙氧基磷酰化亮赖叉肽甲酯((DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3)对K562细胞的促凋亡作用。合成了(DIPP-L-Leu)2-L-Lys-OCH3,通过质谱、磷谱、氢谱和碳谱进行结构鉴定。通过MTT比色实验得到:该样品对K562细胞的半抑制浓度为22.66μmol.L-1。AO荧光染色、DNA琼脂糖凝胶电泳和Annexin -FITC/PI双染实验表明:该样品对K562细胞的增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的。Caspase活性分析实验证明该样品是通过线粒体途径启动细胞凋亡。     

海南产花鳗鲡细胞色素b基因的克隆及序列分析

线粒体细胞色素b基因是目前研究鱼类分子系统进化的重要分子标记.笔者以日本鳗鲡线粒体基因组序列为模板设计并合成引物进行PCR扩增,并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和纯化后,克隆到pMD18-T载体、测序,成功得到全长为1 140 bp的海南产花鳗鲡细胞色素b(Cyt b)基因序列.将该基因全长序列递交到Genebank数据库,获得序列登录号为EF690363.用DNA分析软件MEGA2比较了海南产花鳗鲡与递交到GenBank中的8种分布在中国东南沿海、日本海域及南太平洋海域的鳗鲡属(Anguillia)细胞色素b基因的地理差异,并构建了系统进化树.结果显示:日本产和夏威夷产花鳗的地理差异小于海南产花鳗与它们之间的地理差异.     

海洋嗜盐古菌功能物质利用的遗传工程技术研究报告

极端嗜盐古菌是古菌域的一个重要生理类群,可以产生具有重要价值的产品,如生物可降解塑料PHBV和生物纳米材料紫膜等,但相关基础研究及生物技术亟待加强。该研究以重要海洋嗜盐古菌为材料,在基因组水平开展了其重要功能物质生物可降解塑料PHBV合成关键基因和途径的解析,以及其遗传、代谢及生物工程利用技术的研究,已取得如下研究成果:(1)完成了两株产PHA的极端嗜盐古菌的基因组注释和分析工作,通过基因敲除等手段,鉴定100多个与PHA代谢、碳源利用及调控相关的新基因,包括合成PHBV的关键酶基因pha A、bkt B、pha B、pha E和pha C;PHA颗粒结构蛋白编码基因pha P;以及一系列PHBV途径特异性基因等,形成了对嗜盐古菌PHA合成生物学的系统认识。(2)结合功能基因组及分子生物学技术,首次揭示极端嗜盐古菌合成PHBV独特的代谢途径,尤其是发现了4条可利用非相关碳源合成丙酰-Co A,进而为合成高质量PHBV提供3HV前体的独特的代谢途径。还利用功能基因组学等方法,在基因组水平研究了嗜盐古菌PHA可能的代谢调控机制。(3)构建了两株极端嗜盐古菌高效遗传操作系统,尤其是高效的基因敲除体系和基因表达系统。通过敲除富盐菌胞外多糖的编码基因,获得了PHBV产能优化的工程菌株。(4)建立了富盐菌及其工程菌生产生物塑料PHBV的5L发酵缸发酵工艺,发酵水平由前期的2 g/L提高到25.15 g/L(占细胞干重的50%);同时,发现该菌可利用更加廉价的几丁质和水解的纤维素作为碳源积累较高水平的PHBV。发酵条件的优化和廉价碳源的使用明显降低了PHBV的生产成本。该研究开辟了PHBV在古菌域中的遗传工程研究与开发的新领域,揭示了极端嗜盐古菌PHBV合成关键基因及其独特的代谢途径,研发了相关遗传操作与发酵技术,获得了性能提高的工程菌。这不仅为生产优良性能的PHBV提供了理论指导,还为降低PHBV生产成本,向实现其工业化生产迈进了重要的一步。     

冠突伪尾柱虫休眠与营养细胞线粒体DNA的比较

为研究纤毛虫休眠状态下线粒体的行为特征及功能与纤毛虫形成包裹的关系，采用RAPD 技术对冠突伪尾柱虫休眠与营养细胞线粒体DNA进行了比较。结果表明，在选用的15条随机引物中，有5条引物的扩增产物完全相同，其余10条引物的扩增产物各有差异。15条引物共扩增出84条片段，其中共享片段为28条，共享度为66.7％。这说明休眠细胞线粒体DNA 与营养细胞线粒体在很大程度上是一致的，但仍存在一定差异，据此推测细胞在形成包囊的过程中，某些线粒体DNA结构可能发生了改变，这些改变可能与线粒体在包囊内的行为特征及功能有关。     

细胞色素b基因序列变异与东亚 科鱼类系统发育

采用PCR技术获得了中国 科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因1138bp全序列，所得序列与GenBank中分布于日本，韩国和俄罗斯的 科2属9种鱼类同一基因序列排序，并选用鲇形目鲇科的大口鲇，钝头Wei科的鳗尾 以及脂鲤目的断线脂鲤作外类群，分析了细胞色素b基因序列，计算了Kimura双因子遗传距离和 科鱼类线粒体DNA的进化速率，用最是约法和邻接法构建了 科鱼类分子系统树，得出如下结论：（1）线粒体DNA序列分析显示所测定的鲇形目鱼类细胞色素b基因序列中，存在3bp的缺失。（2）系统发育分析示 科构成一单系类群； 属为较为特化的属，拟 属为一明显的类群，而黄颡鱼属与Wei属关系较为混乱；（3）东亚 科鱼类线粒体DNA的进化速率约为每百万年0.18%-0.30%,本文是中国鲇形目 科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因序列的首次报道。     

放线菌次级代谢产物合成基因簇异源表达体系的研究进展

基因簇的异源表达在放线菌次级代谢产物的发现、产量优化、生物合成途径的解析以及非天然代谢产物合成途径的构建中得到了广泛的应用,成为主要策略之一。近年来,随着高通量测序技术以及基因编辑技术的快速发展,大量的新颖次级代谢产物合成基因簇被发现,异源表达在研究放线菌次级代谢产物中起到越来越关键的作用。基于此,回顾了异源表达技术在次级代谢产物研究中的关键作用,并对其潜在的应用前景进行了展望,旨在为基因簇异源表达技术更为广泛的应用提供参考。     

人类干细胞线粒体外膜蛋白PPI网络构建与分析

线粒体上多种膜蛋白既在细胞能量代谢中起关键作用,同时也参与细胞凋亡的调节,其功能障碍将直接或间接引起多种疾病.本研究从公共数据库MitoMiner,SwissProt和MitoP2中的线粒体外膜蛋白数据,同时获取了15个人类干细胞不同条件下的转录组数据集,利用生物信息学方法筛选并除去冗余数据,获得具有文献支持的高可信度的干细胞线粒体外膜蛋白清单.进一步利用BioGRID数据库找出对应PPI关系数据,采用Cytoscape绘制出直观的PPI网络图.分析结果表明,hub节点蛋白ATF2、DDX3X和BCL2的链接数均超过90,半数以上的外膜蛋白链接数超过10.GO和KEGG分析结果表明,与线粒体外膜蛋白相关的蛋白富集的功能为细胞凋亡和代谢途径.分析结果提示了线粒体外膜蛋白相关蛋白参与的主要生物学途径,为后续线粒体的深入研究提供有价值信息.     

浅谈线粒体的自主性

本文综述了线粒体的发现及随后不断深入研究中人们对线粒体自主性的认识。重点叙述线粒体的自主性装置,包括线粒体DNA的大小和信息含量、线粒体核蛋白体的大小、线粒体tRNA、线粒体蛋白质的合成和脂类的合成,还介绍了线粒体自主性的限制以及线粒体遗传系统与核遗传系统的相互作用。     

小麦atpC基因植物超量表达载体的构建

线粒体ATP合成酶是氧化磷酸化过程中ATP合成起关键作用的多亚基复合体,但近来发现它们在植物应对非生物胁迫反应中起着十分重要的作用。因此,对ATP合成酶的各亚基基因功能的研究有助于阐释其在植物逆境条件下的调节机制,并为研究植物抗逆和防卫反应提供新的途径。线粒体ATP合成酶是能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化反应。atpC基因所编码的线粒体ATP合成酶γ亚基是线粒体ATP合成酶的功能亚基。为了进一步研究它在胁迫反应中的功能,以小麦cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出atpC基因。将该基因的cDNA编码序列连接到pCAMBIA1301中,成功构建了小麦pCAMBIA-atpC植物超量表达载体,为后续的转基因研究奠定了基础。     

杜洛克与梅山猪大卵泡消减文库的构建

为了鉴定杜洛克猪相对于梅山猪在大卵泡中高表达的基因,本研究应用抑制性消减杂交技术成功构建了以梅山大卵泡c DNA为driver,杜洛克大卵泡c DNA为tester的消减c DNA文库。结果显示:以G3PDH和β-actin为指标检测文库的消减效率为25,从该文库中获取了350个有效的阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150-750 bp。克隆测序得到74个有效的EST序列,GO分析表明主要与细胞信号、细胞结构、代谢、细胞分化、基因/蛋白质合成、细胞组织防护等功能相关。利用q PCR技术验证了ELTD1、Grb14、SNRPE、CSDE1、ALDH18A1、e IF4E、BMPR-IB等基因在梅山和杜洛克大卵泡中的表达模式。结果发现在两猪种的大卵泡间存在显著性差异。本研究有助于揭示影响猪卵泡发育和生殖数量控制的分子基础。     

柠檬酸对 CHO 细胞生长和代谢的影响

研究了重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)批培养过程中柠檬酸对细胞生长和代谢的影响。结果表明:柠檬酸明显抑制了细胞的生长。与对照组相比,添加12 mm o l/L柠檬酸的处理组细胞的葡萄糖比消耗速率(QG lc)降低了37.5%,渗透压提高了10.0%,乳酸生成量与葡萄糖消耗量的比值增加了27.0%,氨生成量与谷氨酰胺消耗量的比值也增加了。在谷氨酰胺代谢过程中,更多的谷氨酰胺经谷草转氨酶途径生成α-酮戊二酸,参与能量代谢。柠檬酸促使细胞更多地被捕获在G 1期,阻碍细胞的DNA合成,抑制细胞增殖,并促进蛋白的表达。     

核酸制品的开发应用

核酸是生物体细胞中由几十到几千万个单核苷酸聚合而成的高分子聚合物.1868年,英国科学家米歇尔(Miescher)首先从外科绷带的脓细胞的细胞核中发现.第二次世界大战之后,作为了解、阐明生命现象的途径,对脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),核苷酸的生物合成途径,DNA、RNA合成与分解有关的酶系,代谢调节机制,生命信息的复制、传递等方面进行了广泛的研究,取得了惊人的成果.在核酸基础理论研究的同时,对核酸及核酸制品的应用研究也得到快速的发展.     

细胞色素b基因序列变异与东亚鲿科鱼类系统发育

采用PCR技术获得了中国（鱼尝）科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因1138bp全序列.所得序列与GenBank中分布于日本、韩国和俄罗斯的（鱼尝）科2属9种鱼类同一基因序列排序,并选用鲇形目鲇科的大口鲇、钝头（鱼危）科的鳗尾（鱼央）和伦氏（鱼央）以及脂鲤目的断线脂鲤作外类群.分析了细胞色素b基因序列,计算了Kimura双因子遗传距离和（鱼尝）科鱼类线粒体DNA的进化速率,用最大简约法和邻接法构建了（鱼尝）科鱼类分子系统树,得出如下结论:(1)线粒体DNA序列分析显示所测定的鲇形目鱼类细胞色素b基因序列中,存在3bp的缺失;(2)系统发育分析显示（鱼尝）科构成一单系类群;（鱼艹）属为较为特化的属,拟（鱼尝）属为一明显的类群,而黄颡鱼属与（鱼危）属关系较为混乱;(3)东亚（鱼尝）科鱼类线粒体DNA的进化速率约为每百万年0.18%～0.30%.本文是中国鲇形目（鱼尝）科鱼类线粒体DNA细胞色素b基因序列的首次报道.     

荣昌猪肝组织全长cDNA文库的构建和EST测序及分析

研究旨在为荣昌猪种质资源的保存、开发和挖掘提供重要的分子信息,同时也为荣昌猪作为生物医学模型,代谢疾病的研究提供基础数据.运用SMART法构建了荣昌猪肝组织的c DNA文库,并从文库中随机挑取部分克隆进行EST测序和功能注释.经检测,构建的原始文库滴度为4.19×106pfu/m L,重组率为96.31%,平均插入片段长度主要在400~2 000 bp之间.总共获得了226条有效EST序列,共计161个unigenes,包括19个重叠群(contigs)和142条单一序列(singlets).101(62.73%)条为已知功能基因序列,60(37.27%)条为未知功能序列,其中40条为新基因序列.GO分类和KEGG途径分析揭示大量荣昌猪肝组织表达基因主要与细胞质部分、细胞外的区域、受体结合,化学反应及细胞分解代谢过程等相关;表达的基因主要涉及代谢、补足物和凝固级联和核糖体等功能信号途径.研究采用SMART法成功构建了荣昌猪肝组织全长c DNA文库,并进行EST测序及分析,综览了荣昌猪肝组织基因表达及功能分类特征.     

哺乳动物细胞线粒体基因组的转录及调控机制研究进展

目的:系统的归纳和总结近年来哺乳动物线粒体基因组转录及调控机制研究的进展,以期为哺乳动物和人类线粒体疾病及相关医学领域的研究提供参考依据。方法:从哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)的结构和转录过程,转录基本元件和转录机制等方面,检索和整理近年来关于哺乳动物细胞线粒体基因组的转录及调控机制的文献并进行总结。结果:线粒体是哺乳动物细胞中普遍存在的具有独立基因组的半自主性细胞器,其主要功能是通过氧化磷酸化为细胞提供ATP,同时对于物质代谢、细胞周期调控、细胞分化和凋亡、细胞信号传递等生理过程发挥着重要作用。近年来对线粒体基因组的转录及其调控机制的研究已取得了一些突破和成果。结论:哺乳动物线粒体基因组的转录与调控机制的研究不仅有助于深入阐明和理解线粒体基因组的表达调控机制,而且也助于揭示临床线粒体病的发病机制。     

基于微流控芯片的细胞共培养技术研究进展

细胞共培养技术一般用于研究细胞与细胞间的通讯机制,对揭示多细胞生物生理和病理过程具有重要意义.基于微流控芯片的细胞共培养技术能够模拟原生微环境以进行复杂的代谢和调控,为研究细胞与细胞间通讯提供了新的共培养技术平台,已经广泛应用于肿瘤转移及分析、抗癌药物筛选、药物吸收和药物代谢等领域.本文从微流控芯片上细胞共培养系统的设计、共培养系统上的检测以及模型的应用方面进行了总结和展望.     

基于相对熵原理构建生物进化系统树

根据相对熵原理定义了物种进化距离,把它应用到基于DNA序列分析的生物进化系统树构建的研究中.首先选用64种脊椎动物的线粒体DNA序列为材料,得到与传统的根据物种形态构建的系统树基本一致的树形;进而进行全基因组序列层次的物种进化的研究,选取长度约为线粒体DNA序列102倍的12种古生菌、真细菌全序列,最终也得到了合理的系统树.     

大鼠再生肝8种细胞的嘌呤核苷酸代谢基因转录谱预示的代谢活动

为了解大鼠肝再生中肝细胞、胆管上皮细胞、卵圆细胞、星形细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、陷窝细胞、树突状细胞等8种肝脏细胞的嘌呤核苷酸代谢基因转录谱及预示的代谢活动,按张丽君[1]等方法分离大鼠部分肝切除后10个恢复时间点大鼠再生肝的上述8种细胞,用RatGenome2302.0芯片等检测嘌呤核苷酸代谢基因在上述细胞中表达变化,用Excel等软件及生物信息学和系统生物学等方法分析它们的表达模式、预示的生理活动等.结果表明,85个嘌呤核苷酸代谢基因在大鼠肝再生中发生了有意义表达变化,8种细胞的相应基因数为40,43,30,42,22,26,36和48.上调、下调、上/下调的基因个数为49、11、31,相应细胞的基因数为27、20和1,31、4和1,15、7和3,12、10和0,23、15和3,19、7和2,39、3和1,33、6和0.其中,催化DNA合成的DNA聚合酶基因和催化RNA合成的RNA聚合酶基因在肝再生的多个时间点和多种细胞中表达增强,胆管上皮细胞和星形细胞的腺苷酸合成相关基因表达增强.肝细胞、卵圆细胞和星形细胞的核苷酸分解相关基因、肝细胞、星形细胞和树突状细胞的嘌呤核苷分解相关基因表达减弱.预示大鼠肝再生与嘌呤核苷酸代谢密切相关.