抗体夹心酶联免疫吸附法测定鸡白细胞介素-2

利用抗鸡白细胞介素-2(ChIL-2)单克隆抗体作包被抗体、生物素标记的抗ChIL-2多克隆抗体作检测抗体建立了一个抗体夹心酶联免疫吸附测定系统.此系统对鸡白细胞介素-2的检测灵敏度为50 pg/mL.两种抗体与鸡干扰素-α和人白细胞介素-2等细胞因子不产生任何非特异性反应.以不同种类的促有丝分裂剂或鸡病毒刺激鸡淋巴细胞,培养液中分泌产生的天然鸡白细胞介素-2的量用此系统检出.在促有丝分裂剂中, 植物血凝素(PHA)导致ChIL-2的产生量最高; 在病毒方面,传染性法氏囊病毒最能促使ChIL-2的分泌.本研究建立的抗体夹心酶联免疫吸附测定系统为我们以定量方式测定鸡白细胞介素-2提供了一个灵敏度高、特异性好的工具.     

一种适用于教学的酶联免疫吸附试验的抗原抗体系统制备

目的:探讨设计一种教学成本低、便于教学使用、有助于培养医学生综合实验设计能力和提高实验基本操作技能的酶联免疫吸附实验抗原抗体系统.方法:以提纯的人IgG免疫家兔获取兔抗人IgG抗体,再用其包被酶标反应板,以人血清(人IgG)作抗原,用酶标记羊抗人IgG抗体结合抗原及催化底物显色反应.结果:该双抗体夹心法,底物显色反应清楚肉眼即可作出判定,非特异干扰极小.结论:我们设计的酶联免疫吸附实验-双抗体夹心法原理清晰、便于理解和掌握、教学成本较低、结果易于观察、便于教学大量使用.     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

ELISA方法检测人外周血中的IL-18

建立了一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的酶联夹心ELISA方法,可定量检测人外周血中的白细胞介素18(hIL-18)。将体外重组表达的hIL-18蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,纯化兔血清中的抗体IgG,用辣根过氧化物酶(HRP)标记,检测正常人血清样本中的hIL-18。此方法灵敏度高,可重复性良好,且结果数据化。适合于IL-18的临床定量检测,为进一步开展研究提供了有力的工具。     

两种方法检测汉坦病毒滴度的比较研究

【摘要】 目的：比较双抗体夹心ELISA法与直接免疫荧光(DFA）法在检测汉坦病毒灵敏度方面的差别。方法：用汉坦病毒76-118株感染Vero-E6细胞,取不同时间点的病毒感染细胞制备细胞爬片或细胞培养物冻融上清,分别用本室制备的抗汉坦病毒单克隆抗体标记荧光素或辣根过氧化物酶（HRP）建立直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测上述细胞中的病毒抗原,并比较两者的检测灵敏度,用空斑形成实验结果作为金标准,以评价两种方法在检测病毒抗原灵敏度方面的差异。结果: 用两种检测方法测定不同时间点的汉坦病毒培养物抗原,双抗体夹心ELISA法不仅检出的时间早,而且其病毒滴度均较IFA法高（P＜0.01）。结论：ELISA法检测汉坦病毒滴度的灵敏度较IFA法更高,并且操作简单,可重复性好,便于大批量规模化检测,因此更适用于汉坦病毒的检测。     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

抗紫杉醇抗体的制备方法

用化学方法将紫杉醇（Ｔａｘｏｌ）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联制成全抗原Ｔａｘｏｌ－ＢＳＡ．以Ｔａｘｏｌ－ＢＳＡ免疫家兔后收集抗血清，分离纯化抗体，经酶联免疫吸附法测定证实抗血清中有特异性抗紫杉醇抗体，将纯化的抗体进行免疫双扩散鉴定，结果表明其有较高滴度（３．２×１０２）．     

抗紫杉醇抗体的制备方法

用化学方法将紫杉醇（Ｔａｘｏｌ）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联制成全抗原Ｔａｘｏｌ－ＢＳＡ。以Ｔａｘｏｌ－ＢＳＡ免疫家兔后收集抗血清，分离纯化抗体，经酶联免疫吸附法测定证实抗血清中有特异性抗紫杉醇抗体，将纯化的抗体进行免疫双扩散鉴定，结果表明其有较高滴度（３．２×１０＾２）。     

IB-ELISA诊断试剂的研究

目的　为鸡群日常监测传染性支气管炎病毒 (IBV)抗体提供一个方便、特异、快速的检测方法。方法　利用 9日龄SPF鸡胚尿囊腔接种培养IBV ,以及鸡胚成纤维细胞传代培养IBV ,经纯化后 ,测定蛋白含量 ,作为包被抗原 ,利用过碘酸盐法标记兔抗鸡IgG作为酶结合物 ,用TMB作为显色剂 ,建立起酶联免疫吸附试验 (ELISA)技术 ,检测血清样品中传染性支气管炎抗体。结果　上述两种方法制备的抗原皆可用于此试验 ,与NDV、MDV、IBDV、AIV、APIV、REV、ILTV、IC、MG、MS等抗血清无交叉反应 ,与IDEXXIB ELISA比较 ,结果吻合较好。结论　本研究制备的IB ELISA诊断试剂 ,可用于日常监测传染性支气管炎病毒抗体     

双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒方法的初步建立

用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法. 经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件为:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1: 8 000(浓度为3.531 ug/mL),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1: 800,酶标二抗的工作浓度为1: 4 000. 与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EDS-76V)等均没有交叉反应. 结果表明,本方法具有很高的特异性.     

应用酶联免疫吸附试验检测山羊日本血吸虫病抗体的研究

本研究首先制备了日本血吸虫水溶性止卵抗原和兔抗山羊酶标复合物。经测试确定了:抗原的最适包被浓度(5ug/ml);酶标复合物的最佳工作浓度(1:2500)以及血清不同稀释度下的阴—阳临界值,从而成功地建立了山羊日本血吸虫病抗体的酶联免疫检测法。以1:80稀释作参考,对25份标准阳性血.清和19份标准阴性血清的考核结果证实:在最适条件下,该法特异性,敏感性良好,具有临床和科研应用价值。随后,应用酶联免疫吸附试验对7只实验山羊血吸虫病抗体消长作了长期、细致地观察,结果表明:特异性IgG最早于尾蚴感染后第40天出现;吡喹酮治疗后,7个月消失。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得抗人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCG-β)单克隆抗体,以hCG为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到4株分泌抗hCG-β单克隆抗体(McAb)细胞株.酶联免疫吸附测定(ELISA)结果表明,所得抗体均为IgG1,κ型,其腹水效价均可达10-6.     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

间接酶联检测法浅谈

比较了间接酶联检测法和双抗体夹心法检测烟草花叶病毒(TMV)的结果，检测提纯的病毒和叶片榨汁中的病毒，间接酶联检测法的灵敏度都比夹心法高．     

夹心ELISA检测新冠病毒及其抗原方法的建立和验证

研究制备了快速检测新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）及其表面刺突糖蛋白受体结合域（receptor-binding domain,RBD）的ELISA试剂盒.该试剂盒由一对RBD单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体，其中检测抗体进行辣根过氧化物酶（HRP）偶联，通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA的最适工作条件.另外，对检测试剂盒进行线性、特异性、准确度、精密度等进行了验证.结果表明，双抗夹心ELISA方法中捕获抗体和酶标检测抗体的效价分别为1∶160 000和1∶320 000，试剂盒的定量检测下限为31 ng/mL.经验证，组装的试剂盒精密度为0.71%～1.59%，平均准确度为96.53%，与其他的同种属灭活病毒无交叉反应.试剂盒各项参数均符合《中国药典》（三部）2020版标准，表明该试剂盒适用于新冠病毒以及RBD抗原的快速检测.     

五种赤潮藻单克隆抗体的制备

目的：建立分泌抗海洋褐胞藻(Chattonella marina)、卵圆褐胞藻(Chattonella ovata)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、具齿原甲藻(Prorocentrum dentatum)、尖刺拟菱形藻(Pseudonitzschia pungens)等5种藻的高特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株．方法：利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过反相间接血凝、间接酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法筛选克隆阳性杂交瘤细胞株．结果：获得15CA7、23BG2和23BG9等3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与5种藻具有一定的特异性,但抗体的亲和力较低,仅与海洋褐胞藻具有较高的亲和力;而获得的M18杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可与以上除尖刺拟菱形藻外4种藻产生高效价的明显交叉反应。结论：获得了3株分泌对5种藻具有一定的特异性较低亲和力抗体;而M18细胞株分泌的单抗与除尖刺拟菱形藻外4种藻产生明显的高效价的交叉反应,显示此单抗可代替5种海洋藻的抗血清．     

酶联免疫吸附试验在口蹄疫研究中的应用

作者从口蹄疫病毒(FMDV)抗原的检测、抗原决定基定位、抗体的检测、型间的交义反应等方面对酶联免疫吸附试验在口蹄疫研究中的应用作了综述。     

抗沙门氏菌O8因子单克隆抗体的研制及初步应用

制备抗沙门氏菌O8因子单克隆抗体,建立C2、C3亚群沙门氏菌酶联免疫吸附分析检测方法.用加热灭活的纽波特沙门氏菌免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合建立分泌抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA法检测及鉴定单克隆抗体,酶联免疫吸附分析法初步判断抗体应用于检测试剂的可能性.得到4株与沙门氏菌C2、C3亚群菌株发生反应的单克隆抗体细胞株,分别命名为6F2、7A2、8D8和8D9;4株抗体与肠道正常细菌和常见的致病细菌无交叉反应;单克隆抗体免疫球蛋白类型分别为小鼠IgG_1、IgG_3、IgG_(2b)、IgM,轻链均为kappa;用单克隆抗体7A2和8D8研制的酶联免疫吸附分析试剂盒,对沙门氏菌C2亚群的纽波特沙门氏菌、波那雷恩沙门氏菌和C3亚群的肯塔基沙门氏菌的最低检出值均可达到10~5cfu/m L.获得的单克隆抗体具有较高的特异性,有可能应用于生产检测C2和C3亚群沙门氏菌的酶联免疫吸附分析试剂盒.