小鼠转基因及传代研究

综述了湖北省农科院生物技术研究所近年来有关转基因小鼠的主要研究进展。应用原核注射技术 ,将POMT PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT HBV 1 3、Bcl xL、hCD5 9、hCD5 9+hMCP等 8种外源基因 ,注入并移植 4 874枚小鼠的受精卵 ,得到 5 5 6只小鼠 ;经PCR和Southern杂交检测 ,确认原代转基因小鼠 10 8只。基因整合率平均 19.4 % ,转基因效率平均 2 .2 %。应用混合注射的方法得到了转双基因小鼠 ,双基因共整合率 2 2 .2 %。表达外源蛋白的转基因小鼠在 5 0 %～ 10 0 %之间。研究了小鼠的超数排卵和影响转基因效率的几个因素。通过转Bcl xL小鼠与非转基因小鼠连续五个世代的传代交配和检测 ,研究了转基因小鼠外源基因的遗传规律 ,表明四只原代小鼠中 ,只有一只能稳定地将外源基因传递给后代。并非所有的转基因小鼠都具有遗传的稳定性 ,欲建立小鼠的转基因品系 ,尚需对原代转基因小鼠进行筛选。     

脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1转基因小鼠制备

目的制备脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1(Insulin-Like Growth Factors 1,IGF-1)转基因小鼠。方法采用精子为载体法进行基因转导,出生后小鼠PCR检测,建立转基因小鼠系,用Western blot和免疫荧光法分别检测转基因小鼠海马齿状回亚粒状区(subgranular zone,SGZ)IGF-1表达量和报告基因EGFP阳性细胞数。结果获得3只阳性小鼠,2只外源基因能稳定遗传,并建立了转基因小鼠系,转基因鼠SGZ区域IGF-1表达量显著高于正常鼠,EGFP也在此区域表达。结论成功制备IGF-1转基因小鼠。     

转基因小鼠乳腺表达人乳过氧化物酶的初步研究

从人基因组PAC文库中筛选出人乳过氧化物酶（hLPO）基因,利用长片段PCR的方法获得hLPO基因5’端约3kb片段,通过酶切方法获得hLPO基因3’端约27kb片段,将这两部分拼接并克隆到乳腺特异性表达载体pBC1上,构建以山羊β-casein启动区指导的hLPO的转基因表达载体pBC1-hLPO。利用显微注射的方法获得28只FO代小鼠,经PCR检测和Southerm杂交分析证实,有5只小鼠（4♂,1♀）为整合hLPO基因的转基因阳性小鼠,整合率为17.86％,整合拷贝数在1至5之间。利用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot印迹分析FO、F1代共3只雌性转基因小鼠乳样,结果表明hLPO重组蛋白的特异条带不明显。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠外源基因的复制和传代稳定性观察

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠外源基因的复制、传代稳定性.方法通过nest-PCR和Southern分子杂交等检测方法,对48#、87#、90#三个系列中各15只整合阳性小鼠定期进行血清中HBV DNA存在情况以及对各系列繁育F1-F5代小鼠外源基因整合传代进行检测.结果各系列转基因鼠血清都有HBV DNA存在,并以1月龄时血清中HBV DNA阳性率最高,但随月龄改变,其DNA阳性率也变化,并存在系列、个体及月龄上的差异.结论HBV基因可在转基因小鼠体内复制、传代,且目前已稳定传至第五代(F5).     

Pygo2转基因小鼠模型的建立及表型的初步分析

主要通过建立Pygo2转基因小鼠的模型对其表型进行初步分析.首先构建K14-2×flag-Pygo的转基因构件,经酶切、纯化后构建Pygo2转基因小鼠.出生后的仔鼠用PCR和Western方法检测基因型,并通过进一步的免疫组化验证Pygo2基因的表达.PCR检测获得7只转基因阳性鼠,6只Western检测为阳性.对转基因小鼠子代的胚胎和成体进行免疫组化证明,Pygo2基因在皮肤和乳腺组织中有过量表达.转基因小鼠的皮肤、乳腺以及鼠尾椎骨等组织出现了异常的表型.乳腺中有肿瘤组织的形成,且Pygo2在肿瘤中有大量表达.该模型的成功建立为进一步研究Pygo2的功能奠定了基础.     

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．     

用精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的　探讨精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性 .方法　构建乙肝病毒X基因表达载体 pcDNA3 X ;应用微量注射针将脂质体包裹的 pcDNA3 X表达载体直接注入C5 7BL/ 6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内 ,于第一次注射后 6周 ,与雌鼠交配 ,用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的 pX蛋白 .结果　共产仔鼠 16只 ,其中 1只为阳性仔鼠 ,阳性率为 6 .2 5 %.结论　初步明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的 .     

MT—hGH基因注入小鼠受精卵的研究

用显微注射法，将MT－hGH融合基因注入昆明白小鼠受精卵雄原核中，受注的原核卵经体外培养发育的198枚2细胞胚、45枚桑椹胚和161枚胚泡，移植到54只假孕受体，其中16只妊娠产仔只，存活到供试的仔鼠25只，小鼠长到3个月后，切尾制备DNA，经DNA斑点杂交和Southern印迹杂交检测基因整合情况，25只小鼠中3只有融合基因整合，称为转基因小鼠，仔鼠21日龄离乳后饮水中加入锌（Za^ )，以诱导融合基因表达，85日龄时，转基因小鼠体重比对照组重32．0％，还讨论了基因整合方式对胚胎发育的影响。     

Vill转基因小鼠的制备

摘要:目的　通过制备Vill转基因小鼠研究该基因的功能。 方法与结果　首先由RT-PRC方法获得全长约2605bp的Vill基因;经T载体克隆测序验证后,以克隆载体pMD19-T-Vill为模板,设计引物并引入酶切位点,将PRC扩增产物与pEF6/V5-His-LacZ同时进行酶切、连接,构建表达载体pEF6/V5His-Vill;经真核表达验证后,酶切获得含Vill基因的显微注射DNA构件;显微注射390枚受精卵后,在出生存活的77只仔鼠中获得转基因阳性GO代小鼠19只,其中16只能够稳定遗传并建系,转基因阳性小鼠外观未有明显改变。 结论　Vill转基因小鼠为该基因的功能研究准备了实验材料。     

转基因——从实验动物开始的一种生物工程技术

１转基因技术的历史背景转基因是指通过重组ＤＮＡ技术，将外源基因导入生物体内，外源基因能稳定整合在染色体基因组上并遗传给下一代。众所周知，实验动物在二十世纪曾作出过许多伟大的贡献，其中之一就是生物的转基因，它是首先在实验动物小鼠上获得成功的。由于转基因...     

豌豆豆球蛋白（leguminA）基因的PCR扩增与鉴定

豆类的贮存蛋白是人类的植物蛋白主要来源之一,稻米平均蛋白质含量只有8％,而且人类必需的赖氨酸含量较少。如果将较富赖氨酸的豆类贮存蛋白基因转移到水稻中,提高稻米的蛋白质和赖氨酸等氨基酸的含量,是改善米质的重要途径之一。 Sun首先从法国菜豆中分离出菜豆贮存蛋白基因(Gl),随后,Lycett分析了豌豆主要     

重组TgoDNA聚合酶的特性

检测了重组Tgo酶的扩增性能、 耐热性以及长距离PCR能力， 结果表明, 该重组酶扩增性能与Taq酶相当； 其耐热性极强， 在 95 ℃ 40 min， 仍具有很强的聚合活性； 利用重组酶在常规PCR条件下， 成功扩增了5.3　kb的拟南芥Timeless基因片段.     

绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

水稻基因整合平台系统供体质粒pURKMT的构建

提高水稻产量,改良稻米品质是育种学家广泛研究的课题．随着现代生物技术的发展,水稻已成为植物基因工程的重要研究对象．许多实验室已成功地建立了一系列供外源基因转化水稻的系统．但是这些转化系统主要应用Ｔｉ质粒衍生的载体,通过Ｔ－ＤＮＡ左右两端的序列将目的基...     

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶基因克隆的筛选及序列分析

用改进方法提取粘质沙雷氏菌染色体DNA.通过PCR扩增,得到几丁质酶(chiA)基因,利用pUC19质粒构建了含有chiA基因的克隆载体 ,并转化E.coli DH5α.经测序分析,证明克隆片段与文献报道基本相同,仅在第437位碱基由C变为T.     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

供精个体和异种动物精浆对小鼠精子介导转染外源基因效率影响的研究

目的探讨供精个体和异种动物精浆对小鼠精子转染外源DNA效率的影响,以探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的影响因素。方法从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子,用DIG免疫组化方法检测和比较精予转染效率,因素为供精个体和异种动物精浆。结果不同供精个体间转染效率存在一定差异,但有的个体问差异极显著（P〈0．01）,而有的个体间差异不显著：共孵育体系中异种动物精浆可显著降低转染效率（实验组与对照组分别为（8．6±1．7）％VS（51．3±5.3）％,P〈0．01）。结论小鼠供精个体和异种动物精浆可影响小鼠精予转染外源DNA的效率。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

Expression of biologically active human clotting factor IX (hF IX) in the mammary gland of transgenic mice

The DNA of human factor IX (hF IX) gene vector pMC IX m, which had been proven to be able to express inin vitro and living cells, was introduced into 586 zygotes of Kunming Whlte Mice by positive pressure microinjection technique with manual operation. The 499 survival embryos after microinjection were then transferred into pseudopregnant recipient mice and 216 F, pups were born. The analysis of PCR and Southern blot hybridization showed that, of the 216, 6 (2 females and 4 males) were integrated with foreign DNA in their genornes, giving an integration frequency of 3% (6/216). Two F₀ female transgenic mice could express hF IX protein in their milk and the content was over 100 ng/mL as measured with ELISA. The biological activities of hF IV in the milk of two F₀ mike were 44.67 % and 79.43 %, respectively.