p5cs转化水稻细胞系的研究

用基因枪法将豆科植物mothbean（Vigna aconitifolia L．）中的△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（△1-pyrroline-5-carboxylate synthctase，PSCS）基因转化水稻。经PCR扩增和Southernblot分析，证实p5cs基因已整合到水稻细胞基因组中。用250mM NaCl胁迫处理后，发现转基因细胞的脯氨酸含量提高。同时转基因细胞的耐盐性比野生型增强。     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

新疆小拟南芥烯醛双键还原酶基因对转基因烟草耐盐性的影响

为了研究前期从新疆小拟南芥中克隆的编码烯醛双键还原酶(alkenal reductase)Ap AER基因的功能,本研究构建了带有花椰菜花叶病毒(Ca MV)的35S启动子的植物过表达载体35S:Ap AER,并转化至农杆菌GV3101中,采用叶盘法转化烟草获得了转35S:Ap AER基因的烟草。用250 mmol/L的Na Cl溶液分别胁迫转基因和野生型烟草2和4 d,并测定了脯氨酸(Proline)和丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)及过量化物酶(POD)酶活力等生理指标。结果表明:高盐胁迫下14 d,转基因烟草的长势明显优于野生型烟草,转基因烟草普遍植株较高、叶片大、叶色深;转基因烟草的Proline含量、CAT及POD酶活力均高于对照,而反映质膜受损情况的MDA含量显著低于对照。表明过表达Ap AER基因,能提高转基因植株清除醛自由基的能力、提高脯氨酸等渗透调节物质的含量及相关还原酶活性,从而显著提高转基因烟草的耐盐性。     

水杨酸或过氧化氢减轻镉对裸燕麦毒性的研究

对25 d龄的裸燕麦(Avena nuda)植株进行14 d镉(100μM)胁迫处理,与对照相比,植株的干重显著降低。然而,在镉暴露前1 d对植株进行水杨酸(1 mM)或H2O2(5 mM)预处理可有效地缓解镉引发的植株生长抑制。镉抑制生长与植物光合作用的降低和氧化胁迫伤害有关,具体表现为叶绿素含量、二氧化碳同化率、最大光化学量子产量、光系统Ⅱ实际量子产量、抗氧化力等参数显著低于对照植株,而膜脂过氧化水平则明显高于对照。镉对光合作用的抑制可被外施水杨酸部分地逆转,但不受H2O2影响;而水杨酸和H2O2均可减轻镉引发的氧化伤害,且与细胞中抗氧化能力的维持有关。镉胁迫明显提高了细胞的脯氨酸含量,而水杨酸或H2O2处理则有效地阻止其升高。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳所显示的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶同工酶活性与各自的分光光度计测得的酶活性基本一致。研究表明,外施水杨酸或H2O2可保护植物抵御适当浓度的镉引发的生长抑制,其中水杨酸的作用是减缓镉诱导的光合作用抑制与提高抗氧化胁迫能力,而H2O2只是减轻镉诱导的氧化胁迫伤害。     

高山离子芥CbPLDβ基因对转基因烟草抗寒性的影响

为分析高山离子芥CbPLDβ基因的抗寒性价值,本实验构建了高山离子芥CbPLDβ的表达载体PBI121-CbPLDβ并转化烟草,经过筛选及PCR测序鉴定,获得转基因烟草植株.通过低温胁迫实验,分析了转基因烟草的抗寒性,结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,在低温胁迫下转基因烟草植株的电解质渗透率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量、可溶性糖和可溶性蛋白的含量均高于野生型烟草,说明CbPLDβ基因提高了烟草抵抗低温的能力.     

转蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中，构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中，PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株，RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明，干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照，叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明，转基因烟草植株积累果聚糖，并在干旱胁迫后含量明显增加，而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半；在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制，而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明，转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

Trxs基因对铝胁迫下转基因大麦幼苗叶片抗氧化酶的影响

以过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦为材料,采用水培法研究0.05 mmol/L AlCl3胁迫条件下转基因大麦株系(LSY-11-1-1 )幼苗叶片的蛋白质氧化损伤、膜脂氧化损伤以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),过氧化氢 酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶活性的变化.结果显示:(1)在0.05 mmol/L AlCl3胁迫处理下大麦叶片蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著高于非处理样品,表明铝胁迫 已造成大麦幼苗的氧化损伤;转基因大麦幼苗叶片的蛋白质羰基含量和丙二醛含量显著低于非转基因对照:在胁迫处理6 h、72 h与96 h时其蛋白羰基含量分别为对照的94.4%、87.0% 与71.9%;MDA含量为对照的66.32%、75.74%和74.25%.(2)处理样品叶片中GSH-PX、CAT和A PX等抗氧化酶活性有不同程度的增加;与非转基因对照相比,转基因大麦幼苗叶片的抗氧化酶系活性普遍高于对照:GSH-PX活性在处理12 h、24 h、48 h、72 h与96 h时分别是对照的 1.19倍、1.21倍、1.12倍、1.24倍与1.35倍;APX活性在处理6 h达到高峰时是对照的106.7% .这些结果表明,过量表达Trxs可以有效提高转基因大麦幼苗叶片中上述抗氧化酶类的 活性,缓解铝毒对大麦幼苗叶片蛋白质和膜脂的氧化损伤,从而提高转基因大麦幼苗对铝胁迫的抗性.     

JcERF1基因RNA干扰载体的构建、转化及沉默效果研究

构建了麻疯树(Jatropha curcas)一个新的ERF类转录因子基因RNA干扰(RNAi)载体,并将之转入过表达JcERF1基因烟草体内, 得到了RNA干扰型烟草. 利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测了JcERF1基因的表达量, 发现该基因在干扰型烟草中表达量明显降低. 通过野生型、过表达型和干扰型烟草的种子萌发实验和高盐胁迫实验发现: 与过表达型烟草相比, 干扰型烟草的抗盐能力明显降低, 且干扰型烟草的游离脯氨酸和可溶性糖含量在高盐处理后上升的幅度明显低于过表达型烟草. 以上研究结果说明JcERF1基因在干扰型烟草体内已被有效沉默, 同时说明该基因具有提高转基因烟草抗盐性的功能.     

刚毛柽柳ThPCS 1基因克隆与镉胁迫应答分析

【目的】探究刚毛柽柳(Tamarix hispida)植物络合素合酶(phytochelatin synthase,PCS)基因ThPCS1的镉胁迫应答功能。【方法】通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对刚毛柽柳ThPCS1基因进行克隆;通过BioEdit、MEGA 5.0等软件对ThPCS1蛋白进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析镉(Cd)胁迫条件下ThPCS1基因在柽柳根和叶中的表达水平;构建pROKII-ThPCS1过表达载体,通过瞬时侵染技术获得转ThPCS1基因柽柳,分析比较转基因和对照柽柳Cd胁迫应答相关生理指标和生理染色情况。【结果】从刚毛柽柳转录组数据中分离出ThPCS1基因的全长转录组序列,预测该基因的开放阅读框为1 581 bp,编码526个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为130.75 ku,理论等电点pI为5.0。保守结构域的多重比对分析结果均显示ThPCS1蛋白在N端具有PCS结构域。RT-qPCR结果显示在镉胁迫条件下,ThPCS1基因在柽柳根中被诱导表达,且呈现出组织特异性的表达模式。对镉胁迫处理后的刚毛柽柳ThPCS1转基因植株和对照植株相关生理指标进行测定,结果显示,同对照植株相比,转基因植株的活性氧和镉离子含量降低,细胞膜损伤减小。【结论】刚毛柽柳ThPCS1基因在根中的表达明显受到镉胁迫诱导,可能参与了刚毛柽柳对镉胁迫的应答。本研究初步证明刚毛柽柳ThPCS1基因可能提高了转基因植物的耐镉能力,是一个耐镉分子育种的候选基因。     

干旱预处理对八宝景天响应镉铜胁迫的影响

为探究干旱预处理对八宝景天响应镉铜胁迫的影响,将八宝景天幼苗分别用0%,5%,10%,15%,20%,25%(对应水势分别为0,-0.05,-0.15,-0.30,-0.50,-0.77MPa⁾的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫预处理后,分别用150mg·kg^-1的Cu²⁺和20mg·kg^-1的Cd²⁺胁迫液培养,然后测定八宝景天幼苗叶片的光合色素含量、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量及抗氧化酶(APX,CAT,SOD,POD)活性.结果表明,镉胁迫下10%(-0.15MPa)PEG预处理和铜胁迫下5%(-0.05MPa)PEG预处理可以有效提高八宝景天的光合色素含量,降低MDA含量,增加可溶性糖含量和游离脯氨酸含量,提高抗氧化酶活性.相对于空白(CK)组,10%PEG预处理对八宝景天地上部镉含量和铜含量以及镉、铜转运系数的促进效果最为明显,地上部镉含量和铜含量分别比CK增加了3.87%和3.59%;镉和铜转运系数分别增加了15.4%和5.8%.以上结果表明,...     

盐地碱蓬△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶基因(SsP5CS)的克隆及表达特性

从盐地碱蓬(Suaeda salsa)中克隆了△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶基因的cDNA片段(S.salsa △1-pyrroline-5-carboxylate synthase gene,Ssp5CS).Southern杂交表明SsP5CS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝;Northem杂交结果表明,不同盐处理(400mmol/L NaCl)时间下SsP5CS在盐地碱蓬叶中的表达量明显增加;同时盐胁迫条件下盐地碱蓬叶中的脯氨酸含量与对照相比显著的增加,并且其渗透调节能力也逐渐增强.推测SsP5CS基因可能在保护盐地碱蓬免受盐胁迫损伤的过程中起到重要作用.     

外源硒对NaCl胁迫下番茄幼苗叶片氧化损伤的保护效应

采用营养液培养法,研究外源施硒对Na Cl胁迫下加工番茄幼苗叶片活性氧含量、还原力水平及氧化还原状态、抗氧化酶活性及其基因相对表达水平的影响。结果表明:外源硒(0.01 mmol/L Na2Se O3)的施用提高了Na Cl胁迫下番茄叶片细胞内的还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(As A)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)含量及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG),抗坏血酸/脱氢抗坏血酸(As A/DHA),还原型辅酶Ⅱ/氧化型辅酶Ⅱ(NADPH/NADP+)的比值,调节细胞氧化还原平衡处于还原状态;上调了番茄幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性及Cu/Zn SOD、POD1、CAT2和GPx的基因相对表达量,减少Na Cl胁迫下番茄幼苗叶片活性氧-过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2.-)的产生和积累,降低膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量,从而有效缓解了Na Cl胁迫对番茄植株的氧化胁迫损伤危害。     

Th2CysPrx基因提高酿酒酵母多种胁迫耐受性研究

【目的】过氧化还原蛋白是生物体调节体内氧化还原系统的一种重要蛋白质,在植物生长代谢中起重要作用。前期研究发现过表达刚毛柽柳Th2CysPrx基因的烟草和柽柳中4种抗氧化酶基因(ThGSTZ1、ThGPX、ThSOD和ThPOD)的表达水平上调, 转基因植株的NaCl胁迫耐受性提高。本实验探究Th2CysPrx基因除了响应NaCl胁迫应答,是否还参与其他盐胁迫和其他胁迫的应答。 【方法】将Th2CysPrx构建到pYES2酵母表达载体上,转化到酿酒酵母INVSC1细胞中,分析比较重组酵母(pYES2-Th2CysPrx)和对照酵母(pYES2)细胞在各种非生物胁迫后的生长情况。【结果】过表达Th2CysPrx基因的重组酵母细胞在低温、KCl和LiCl胁迫后存活率与对照相比差异不显著;但H₂O₂、NaCl或NaHCO₃胁迫后酵母细胞的存活率显著提高。此外,高于0.5 mol/L山梨醇或高温(达到44 ℃),或低于质量分数0.007% CdCl₂胁迫后,过表达Th2CysPrx基因能显著提高重组酵母的细胞存活率。【结论】Th2CysPrx基因可以显著增强酵母细胞对NaCl和NaHCO₃胁迫的耐受能力,以及特定的渗透胁迫、高温胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫的耐受能力,但对低温、KCl和LiCl胁迫耐受能力无明显影响。     

低温胁迫对扁蓿豆的脯氨酸含量和POD、SOD酶活性的影响

在不同的低温条件下(15℃,0℃,-10℃,-15℃),以扁蓿豆(盐池扁蓿豆、青藏扁蓿豆、内蒙古直立型扁蓿豆、青海匍匐型扁蓿豆和吉林扁蓿豆)5个品种为材料,研究了扁蓿豆幼苗叶片内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性和游离脯氨酸含量的变化规律。结果表明:随着低温胁迫的加强,5个品种扁蓿豆幼苗叶片内SOD、POD酶活性均呈现先上升后下降的变化趋势,酶活性下降后仍能维持高于对照的酶活性水平;游离脯氨酸绝对含量逐渐增加,从而证明扁蓿豆是通过维持较高水平的SOD、POD酶活性和提高脯氨酸绝对含量等保护机制来适应低温胁迫,减轻低温伤害,通过比较表明青藏扁蓿豆和盐池扁蓿豆的抗寒性较强。     

油菜ICE1基因表达载体构建及转化烟草

从油菜中克隆得到了ICE1基因的开放阅读框序列.构建了以CaMV35S为启动子的植物表达载体,经农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株.通过PCR检测,目的基因成功转入烟草中.将转油菜ICE1基因的烟草和非转基因烟草置于2℃处理7 d,非转基因烟草出现萎蔫,转基因烟草没有明显变化,非转基因烟草丙二醛浓度明显高于转基因烟草.将转基因烟草与非转基因烟草分别置于0、-2、-4℃各1 h后,转基因烟草APX、SOD活性明显高于非转基因烟草.     

番茄SlWRKY1转录因子在植物生物和非生物胁迫中的调控

克隆番茄SlWRKY1基因,构建植物过量表达载体pBI121-35S∷SlWRKY1并通过农杆菌介导的遗传转化法转化番茄,成功获得3株过量表达的转基因植株.研究发现:转基因植株对丁香假单胞菌番茄变种(Pst DC3000)的感染表现出敏感性,表明SlWRKY1基因可以减弱由Pst DC3000引起的植物防御反应,在相关信号通路中起到负调控作用.同时SlWRKY1转基因植株对盐胁迫表现出抗逆性,在胁迫条件下转基因植物中积累了大量的脯氨酸.推测SlWRKY1基因可能参与番茄脯氨酸代谢调控.     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

外源GSH对NaCl胁迫下番茄幼苗生长及AsA-GSH循环的影响

采用营养液栽培法,研究叶片喷施还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和谷胱甘肽合成抑制剂(BSO)对NaCl胁迫下番茄幼苗植株生长、叶片丙二醛(MDA)和H2O2含量、抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环中抗氧化酶活性及氧化还原水平的影响。结果表明:外源喷施GSH通过显著提高NaCl胁迫下番茄幼苗还原力水平和叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、AsA-GSH循环中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DAHR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性,有效提高了活性氧清除能力,显著缓解了NaCl胁迫对番茄幼苗生长的抑制。外源喷施GSSG虽然降低了GSH/GSSG比值,但由于通过上调了AsA/DHA比值和SOD、AsA-GSH循环关键酶活性,一定程度缓解了NaCl胁迫对番茄幼苗生长的抑制作用。喷施BSO显著降低了NaCl胁迫下番茄幼苗叶片的还原力水平和SOD、GR、APX和MDHAR的活性,导致H2O2清除能力降低,从而进一步抑制了NaCl胁迫下番茄幼苗的生长。     

高温胁迫对大豆幼苗生理特性的影响

以豫豆‘19’为材料,研究了大豆幼苗在适温(25℃)和高温(35℃,40℃)下叶片某些生理生化指标的变化,高温胁迫在人工气候箱中进行.结果表明:在高温下,以25℃为对照,随着胁迫时间的延长,RWC含量和总叶绿素(Chl)含量明显下降;MDA含量明显增加,膜脂过氧化作用加强;Pro含量也逐渐增加;SOD活性在胁迫初期明显增加,说明大豆幼苗可通过增加脯氨酸含量以及SOD活性来提高其耐热性.随着胁迫时间延长,SOD活性出现下降的趋势,大豆幼苗受害明显加重.相关分析表明,相对含水量(RWC)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量呈显著负相关(r>-0.91),丙二醛(MDA)含量与脯氨酸(Pro)含量呈极显著相关(r>0.93),可以作为耐热性鉴定指标.     

机械刺激对烟草悬浮培养细胞耐盐和重金属胁迫的影响

机械刺激(mechanical stimulation,MS)是自然界中普遍存在但又易被忽视的一种非生物胁迫因子.用提高摇床转速的方式对烟草悬浮细胞施加机械刺激,发现机械刺激可提高烟草悬浮培养细胞在盐和重金属胁迫下的存活率和再生能力,缓解盐和重金属胁迫下的细胞活力丧失和丙二醛( malonaldehyde,MDA)含量的积累.这些结果表明机械刺激可诱导烟草悬浮细胞耐盐和重金属胁迫耐性的形成.