毛白杨4CL基因启动子的克隆及初步功能分析

4CL(4-coumarate:CoA ligase,4-香豆酸:辅酶A连接酶)在植物木质素合成途径中催化羟基香豆酸生成羟基肉桂酰CoA,主要在木质部中表达,对植物木质素生物合成具重要调控作用.为研究4CL基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程研究中的潜在应用价值,利用PCR方法从毛白杨基因组DNA中扩增得到了4CL启动子片段.序列分析表明与美洲山杨(P.tremuloids)的4CL启动子同源性为95%.采用生物信息学方法对该序列进行分析.与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的瞬时表达检测可见明显GUS活性.     

杨树木质部特异性定位表达4CL1启动子的结构与表达特性

4-香豆素COA连接酶(4CL1)是木质素代谢途径中的一个关键酶,对该基因启动子的表达特性与调控元件进行了研究:首先,对毛白杨4CL1启动子进行了生物信息学分析,结果表明该启动子包括3个顺式作用元件,box P(CCTTCACCAACCCCC),box A(CCGTTC),box L(TCTCACCAACC),这3个顺式作用元件在已知的木质素代谢途径相关酶系如苯丙氨合成酶(PAI)和4CL中普遍存在;其次,运用PCR方法对该启动子进行了剪切,获得一个长393 bp的启动子片断,该启动子片断包括以上3个顺式作用元件;最后,将该启动子片段与GUS报告基因构建了植物表达载体并转化烟草,成功获得转基因再生苗,结果发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性.研究结果表明,一个393 bp长度的4CL1启动子片断足以介导外源基因在木质部特异性定位表达.     

Obtaining the transgenic poplars with low lignin content through down-regulation of 4CL

The antisense 4CL (4-coumarate: CoA ligase)gene was transformed into triploid Chinese white poplar(Populus tomentosa) mediated by Agrobacterium tumefaciens.PCR and Southern blot analysis indicated that antisense 4CLgene had been integrated into the genome of the transgenicChinese white poplars. The antisense gene had also beenexpressed, which was indicated by RT-PCR and Westernanalysis. Klason lignin content assay showed that repressionof 4CL expression could result in remarkable reduction oflignin content in transgenic poplars, with most reduction of 41.73% compared with that of wild type in this paper. Butthere is no significant difference in holocellulose content be-tween trans- genic and wild poplars. We considered that 4CLmight not be the metabolism control point between ligninand carbohy- drate biosynthesis. The stems of transgenicpoplars displayed red-brown color with different levels afterthe bark was peeled, while those of untransformed plantswere white. No visible differences in growth and developmentwere observed between transgenic and wild plants. Wiesnerreaction analysis of the transgenic plant stems with reducedlignin content exhibited red color, while that of untrans-formed plant was typically purple-red.     

GRP1.8融合4CL1基因调控杨树木质素生物合成

将形成层定位启动子GRP1.8与毛白杨的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因融合,叶盘法转化毛白杨741,southern杂交检测表明融合基因已经整合到转基因杨树的基因组中.通过实时定量PCR技术测定mRNA的表达量,GC-MS分析4CL底物香豆酸的含量和定量硫酸木质素含量,分析了4CL基因的过量表达对转基因杨树生理生长的影响.实验结果表明,整合了正义4CL1的转基因植株在茎中的酶活性比野生植株增加了30%,木质素含量增加了40%.     

植物4CL基因家族结构功能与表达特性研究进展

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）是植物苯丙烷衍生物,如类黄酮和木质素等,生物合成途径的一种关键酶,在大多数维管植物中4CL基因以基因家族的形式出现.4CL基因家族成员在植物组织中存在差异表达,并参与不同的苯丙烷类衍生物的生物合成.从4CL酶的基因结构、基因家族组成与表达特性等方面详细论述了当前最新研究进展,这将有助于更好地理解植物4CL基因参与苯丙烷类衍生物途径的合成与代谢机制.     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

Cloning and expressional analyses of a cinnamoyl CoA reductase cDNA from rice seedlings

Cinnamoyl CoA reductase (CCR: EC 1.2.1.44),the entry-point enzyme of the llgnin specific biosynthetic pathway, catalyzes the conversion of cinnamoyl CoA esters to their corresponding dnnamaldehydes. Multiple sequence alignment showed that the deduced polypeptide shared 70% similarity and 30% sequence identity at the amino acid level with defined CCR genes from other plant species and they all contain the common signature sequences thought to be the catalytic site as well as the putative NADP binding domain.Using a conserved OsCCR cDNA fragment as the probe for library screening, we isolated the genomic DNA that covered the whole coding region of OsCCR with total length of 3045bp including 4 introns and 5 exons. The open reading frame for our OsCCR gene coBtAin~ 337 amino adds. Northern blot indicated that OsCCR was expressed in different organs with the highest level found in stems. In situ hybridization results showed that OsCCR mRNA was localized mainly along the vascular bundles in stems and leaves, and also in lateral roots that was differentiating from the tiilering node. We conclude that the vascular-localized expression of OsCCR gene may suggest its possible involvement in llgnin biosynthesis. Cloning and characterization of OsCCR will help to clarify how llgniflcations in plants are regulated and will provide a physical basis for creating genetically engineered rice plants with optimal lignin contents.     

慈竹CCoAOMT基因的克隆及生物信息学分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶是木质素生物合成过程中的关键酶之一。该研究以慈竹嫩茎为材料,采用RT-PCR及RACE方法,克隆CCoAOMT基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明:1个慈竹CCoAOMT基因cDNA全长序列被成功克隆,该序列全长为1 080 bp,含有1个777 bp的读码框,编码了1个包含258个氨基酸的蛋白质,分子质量约为28.861 ku,等电点为5.33,二级结构中α-螺旋占42.25%,β-转角占8.91%,延伸链占15.89%、无规则卷曲占32.95%。对氨基酸多序列比对发现,慈竹与绿竹的CCoAOMT1基因亲缘关系最近,但慈竹CCoAOMT基因编码的氨基酸与绿竹相比,在第10位点上发生了缺失,5个位点发生了变异。慈竹、绿竹、毛竹、玉米CCoAOMT基因编码的氨基酸中都含有1个相对保守的无序化区域。NaC-CoAOMT1基因组织表达结果表明,其在未展开叶、笋上部和中部、茎的上部和中部的表达量较高。笔者将克隆并获得的慈竹木质素合成酶CCoAOMT基因全长序列(GenBank注册号为JF742462)命名为NaCCoAOMT1,分析认为其可能与慈竹木质素生物合成有关。     

大青杨PuZFP 103基因的序列特征及逆境胁迫的表达分析

[目的]通过研究大青杨(Populus ussuriensis)PuZFP 103基因的序列特征及其在不同组织部位、激素处理与胁迫应答中的表达特性,为揭示PuZFP 103在大青杨生长发育中的功能提供依据.[方法]利用各种生物信息学方法对PuZFP 103基因进行分析,采用实时荧光定量PCR(real time qua...     

白桦BpGT14基因表达模式及对非生物 胁迫诱导的响应

为了揭示BpGT14基因的分子结构特征,明确糖基转移酶BpGT14基因的表达模式及其对非生物胁迫的响应机制,初步探索其在白桦生长发育中的功能,在克隆白桦GT14基因全长序列的基础上,利用生物信息学对其理化性质进行了分析,应用实时荧光定量PCR技术分析BpGT14基因在野生白桦植株雄花序、木质部、韧皮部及叶片4个不同部位不同月份的表达差异; 同时,选用白桦茎段悬浮细胞进行了水杨酸(SA)、盐胁迫(NaCl)、重金属镉(CdCl₂)及4℃低温非生物胁迫处理,检测目的基因对逆境的响应情况。研究结果表明,BpGT14基因开放阅读框为1 302 bp,编码433个氨基酸。分析其氨基酸序列发现,该蛋白含有乙酰氨基葡糖转移酶结构域,属于14家族的重要结构域。该蛋白与其他物种GT14蛋白比对分析表明,这些蛋白在100—350氨基酸区域内保守性较高,而且该基因与毛果杨的GT14家族基因同源性高达79%。不同部位不同月份的表达模式分析结果表明,BpGT14基因的表达具有部位及时间特异性,其各部位表达量均与月份相关,同时发现其在木质部、韧皮部及叶片中的表达量较高,而在雄花序中表达量较低。非生物胁迫处理结果显示,BpGT14基因对不同处理均产生响应,但其响应模式不尽相同:SA、CdCl₂及低温处理结果显示,处理初期(6 h)目的基因上调表达,6 h处理时分别达到了对照组的51.2、48.9及3.3倍,24 h后相对表达量与对照组相比均下调,只有低温处理在96 h恢复上调表达; NaCl处理使白桦BpGT14基因的表达量全部呈现下调趋势,24 h处理后,BpGT14基因表达量下调明显,24 h后比对照组降低了93.7%。     

Cloning and expression of a cDNA encoding ribosomal protein S4 from Rice (Oryza sativa)

A cDNA clone, pS4, has been isolated from a cDNA library prepared from rice anthers of about 1.0 mm in length. DNA sequence analysis and database search show that the cDNA encodes a protein which is highly homologous to eukaryotic 80S ribosomal protein subunit 4 (S4). Northern hybridization indicates that this gene expresses in all tissues analyzed although the expression level varies and it cannot be induced by mechanical wounding in leaves. Southern blot analysis demonstrates that this rice S4 gene is from a multigene family.     

Cloning and expression of a cDNA encoding ribosomal protein S4 from Rice (Oryza sativa)

A cDNA clone, pS4, has been isolated from a cDNA library prepared from rice anthers of about 1.0 mm in length. DNA sequence analysis and database search show that the cDNA encodes a protein which is highly homologous to eukaryotic 80s ribosomal protein subunit 4 (S4). Northern hybridization indicates that this gene expresses in all tissues analyzed although the expression level varies and it cannot be induced by mechanical wounding in leaves. Southern blot analysis demonstrates that this riceS4 gene is from a multigene family.     

褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.     

烟草MnSoD cDNA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

烟草锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一种由核基因编码并定位于线粒体的蛋白质,是植物体内清除超氧根阴离子的主要酶类．采用RT—PCR方法,从烟草(Nicotiana tubaccum)中克隆到MnSODeDNA基因(SodA),序列分析结果与文献报告的资料相比,核苷酸序列的同源性为99．9％,氨基酸序列的同源性为99．6％．该基因能在原核表达载体pBV221中正确表达,并表现出SOD酶活性．     

不同花色品种蝴蝶兰花色素苷含量分析及相关基因表达研究

分析红色、黄色、粉紫色和白色蝴蝶兰品种不同开放度的花和叶花色素苷生物合成途径7个结构基因PAL、4CL、CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS基因和3个调节基因的表达.结果显示:10个基因的表达因不同花色、不同发育阶段而异.这10个基因在叶中的表达量相对花较低.黄金甲中PAL、4CL、CHS、F3H、F3'5H基因的表达量均较高,PAL、4CL、CHS和F3'5H在开花期达到峰值,粉色花空港红鹰花DFR、CHS、F3H、F3'5H表达量较高.白色花空港枫叶和黄色花富乐夕阳花中CHS、DFR、F3H、F3'5H和ANS表达量较低.CHS在6个品种花的不同阶段皆有表达.F3H基因在6个品种中表达量较低,与花色素合成不存在直接相关.调节基因b HLH 6个品种各发育阶段的表达量均较高,MYB表达量较低,这些结果表明,蝴蝶兰花色素苷积累是CHS、F3'5H、DFR和ANS等关键结构基因共同表达的结果,编码转录因子b HLH基因的表达可能在花色形成中作用较大.     

松科植物木质素合成相关基因研究进展

植物木质素是影响纸浆材品质的关键因素,而松科植物作为重要的纸浆材,对其木质素合成相关调控基因进行系统了解,可为完善木质素生物合成模型提供一定的理论依据。笔者通过对国内外已有研究进行分析,总结植物木质素结构、木质素合成途径、木质素合成相关酶基因及松科植物木质素合成基因的研究进展。归纳出松科植物火炬松(Pinus taeda)、马尾松(P. massoniana)、辐射松(P. radiata)、挪威云杉(Picea abie)等木质素合成酶基因研究主要集中在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate CoA ligase, 4CL)、肉桂酸4-羟化酶(cinnamic 4-hydroxygenase, C₄H)、香豆酸3-羟化酶(Coumarate 3-hydroxylase, C3H)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A-O-methyltransferase, CCoAOMT)、肉桂酰基辅酶A还原酶(Cinnamoyl CoA reductase, CCR)和肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)等一些常见基因上,其他莽草酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate hydroxycinnamoyl transferase, HCT)、阿魏酸5-羟化酶(ferulo 5-hydroxylase, F5H)、O-甲基转移酶(O-methyltransferase, OMT)及咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase, COMT)等基因研究较欠缺,此外,还有部分基因未涉及。木质素合成是研究松科植物纸浆材的重要切入点,对现有松科植物木质素合成过程中存在问题进行精确的估计,对进一步深入研究松科植物木质素合成机制和优质纸浆材选育具有重要意义。     

粉尘螨Der f4基因的克隆和蛋白分子特征分析

从深圳地区采集粉尘螨纯培养,提取总RNA,根据香港中文大学合成的尘螨基因序列并设计的引物,RT-PCR扩增出Der f4基因,克隆到pUC57载体后测序和进行生物信息学分析.将该目的基因克隆到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET-28a-Der f4.用生物软件分析尘螨变应原Der f4序列. RT-PCR获得目的基因Der f4 cDNA全长为1593 bp.推测编码蛋白由526个氨基酸组成,生物信息学分析表明,Der f4具有多种磷酸化位点,含有信号肽,为疏水性蛋白,包含淀粉酶抑制剂功能结构域.获得Der f4基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有淀粉酶抑制剂活性.