褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

蛋白酶抑制剂mRNA在抗褐飞虱水稻中的原位定位

利用RNA原位杂交技术, 对抗虫水稻B5植株接种褐飞虱若虫72 h后的根、茎、叶组织切片进行了蛋白酶抑制剂基因(E61932)的原位定位. 结果显示, 在未接虫的材料中, 该基因在根、茎、叶等部位都有表达, 但表达水平很低; 褐飞虱取食后, 蛋白酶抑制剂基因在水稻茎、叶的薄壁组织中大量表达, 根中表达较弱, 说明受褐飞虱若虫取食诱导该基因表达上升.     

乙烯信号转导途径在褐飞虱诱导的水稻挥发物释放中的作用

以水稻褐飞虱Nilaparvata lugens及其卵期寄生蜂稻虱缨小蜂Anagrus nilaparvatae为研究对象, 通过分析褐飞虱为害后水稻乙烯释放量的变化以及乙烯、水稻挥发物和对寄生蜂引诱作用三者间的关系, 研究了乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中的作用. 结果表明, 在受褐飞虱为害后2~24 h, 受害稻株释放的乙烯浓度一直显著地高于未处理稻株; 利用乙烯利在酸性水溶液中释放的乙烯处理水稻后, 水稻能释放与褐飞虱为害株相类似的挥发物组成相, 并且两者表现出对寄生蜂相同的引诱活性; 在褐飞虱为害之前利用乙烯受体的抑制剂1-甲基环丙稀处理水稻, 可明显抑制褐飞虱诱导的大部分水稻挥发物组分, 并且对稻虱缨小蜂的引诱作用也受到抑制. 上述结果表明, 乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中是必需的.     

两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位

选用抗源来自药用野生稻（Oryza offcinalis Wall)的抗褐飞虱品系B5为父本,与感虫品种台中本地1号（TN1）杂交,随机选取167个F2单株构成定位群体。运用RFLP技术,采用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA),对水稻抗褐飞虱基因进行分子标记定位。于第3和第4染色体找到与抗褐飞虱基因连锁的RFLP标记。构建了连锁标记附近区域的RFLP遗传连锁图谱,对这两个抗位点进行了QTL（quantitative trait locus)分析,将这两个抗褐飞虱基因分别定位于第3染色体的G1318和R1925,第4染色体的C820和S11182之间。与已报道的水稻抗褐飞虱基因位点相比较,表明这两个抗褐飞虱基因是新的抗性位点。抗褐飞虱基因新位点的发现和分子标记的建立,为水稻抗虫分子标记辅助育种和抗褐飞虱基因克隆打下了良好基础。     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示，79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现，48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA，GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％，遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中，鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明，转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用，具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量，即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

茉莉酸信号传导途径参与了水稻的虫害诱导防御过程

采用RT-PCR的方法, 对茉莉酸信号传导途径在水稻虫害诱导防御中的作用进行研究. 结果表明, 斜纹夜蛾危害能够明显诱导水稻茉莉酸合成途径的关键酶脂氧合酶和丙二烯氧化物合成酶基因的表达, 而且外源茉莉酸处理和斜纹夜蛾危害对脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶以及蛋白酶抑制剂等水稻虫害防御基因的表达有相同(似)的诱导作用, 表明斜纹夜蛾危害可能会诱导水稻启动茉莉酸信号传导途径, 从而使水稻产生诱导防御机制. 虽然机械损伤和褐飞虱危害对脂氧合酶基因的表达有一定诱导作用, 但对丙二烯氧化物合成酶的表达无明显影响. 然而, 褐飞虱危害对水稻防御基因PR-1a和几丁质酶等病原相关蛋白以及水杨酸生物合成途径的关键酶苯丙氨酸转氨酶有不同程度的诱导作用, 说明褐飞虱危害可能启动了水稻水杨酸或其他信号传导途径从而产生诱导防御作用.     

水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以30％（-1.13 MPa）PEG-6000对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用mRNA差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因dil（dehydration induced,dil）的cDNA片段。Northern blot分析表明,dil基因在水分胁迫10h后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫48h时其表达最强。对dil基因的cDNA片段进行了克隆和序列测定（211bp）。经查询,在GenBank中没有与dil同源的基因序列。     

应用cDNA-AFLP比较干旱胁迫条件下水稻和旱稻转录本表达谱

很多年来, 水稻生长在有充足水分供应的稻田中, 而旱稻生长在自然雨水供给的土壤中, 这种长期生存环境的差别造成了旱稻比水稻抗旱. 为了阐明水稻和旱稻干旱抗性的差异调控机制, 应用cDNA-AFLP技术调查了干旱胁迫条件下水稻和旱稻中全基因组的转录本调控. 结果表明, 90%以上的基因在两种稻作基因型中不受干旱胁迫的影响, 多于8%的基因在二者中受干旱胁迫调控, 少于1%的基因在水稻或旱稻中特异表达; 57个基因在旱稻中特异表达, 38个在水稻中特异表达. 旱稻特异表达基因包括可能在干旱抗性中起作用的细胞挽救和防御基因、信号转导分子、生长发育必需的核苷酸和氨基酸生物合成基因以及生长发育调控基因. 而水稻特异表达基因与蛋白质和核苷酸降解有关. 一些基因在旱稻中被较早上调, 而且旱稻中的下调基因也比水稻中下调早, 这表明同水稻相比更迅速的调控机制引起了旱稻对干旱胁迫较早的应答. 旱稻中上调基因的表达水平高于水稻. 水稻和旱稻之间基因表达的差异可能是干旱胁迫条件下旱稻比水稻具有更强的调控能力, 更强的干旱抗性, 更好的生长势的分子机制.     

拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力及体外转录活性分析

通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达.     

基于抑制消减杂交方法的小麦抗白粉病相关基因表达谱

以抗白粉病品系“百农3217×Mardler”BC_5F_4为材料,构建了一个白粉病菌接种初期的抑制消减杂交cDNA文库,获得760条表达序列标签（expressed sequence tags, EST）.在 GenBank上进行BLASTn与 BLASTx分析,结合文库高密度点阵膜的杂交差示筛选,获功能已知的抗病相关EST 65种,199条.通过分析抗病相关基因表达谱,推测 SA（salicylic acid）信号传递系统、MAP相关信号传递系统等参与了小麦抗白粉病过程.SAR（systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类与数量最多.伴随着细胞防卫反应的启动,细胞保卫机制也被激活,抗氧化物质基因大量表达.较多证据证明苯丙烷代谢途径参与了抗白粉病植保素的合成;检测到几种细胞壁结构修饰酶和抑制病原菌生长的蛋白酶抑制因子.以半胱氨酸蛋白酶为主的几种蛋白酶基因在已知功能EST中有一定的表达频率.     

水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定

以优良杂交水稻的恢复系明恢63为材料，构建覆盖水稻基因组的cDNA文库，用于功能基因组的研究。选择水稻全生育期过程的9个时期的不同组织和病原诱导的组织分别构建了15个定向cDNA文库。依据基因组DNA饱和杂交的原理，将从15个独立的cDNA文库中提取的质粒混合，并与固定有磁珠上具有互补性的2份基因组DNA亲和体系饱和杂交，收集杂交组分中的质粒并重新转化大肠杆菌，获得全生育期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.4kb，含62000个克隆子。反向Northem杂交显示，该文库收集了众多表达丰度极低的基因以及特异表达的基因。对文库中随机的10750个克隆进行了测序，序列分析比较后获得6399条非重复的EST(expressed sequence tag)序列，非重复序列占59.5％。目前，用该文库制作的cDNA芯片已被用于功能基因组的研究。     

13个水稻WRKY基因的克隆及其表达谱分析

转录调控因子WRKY蛋白拥有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和Cys₂His₂或Cys₂HisCys锌指型结构. 利用WRKY蛋白质的保守结构域, 搜索了整个水稻基因组编码WRKY蛋白质的基因, 鉴定了97个WRKY基因, 并从4℃胁迫的水稻植株cDNA文库中获得13个WRKY基因全长cDNA克隆. Northern blotting分析结果显示, 其中10个WRKY基因的表达受到NaCl, PEG, 低温(4℃)和高温(42℃)等4种非生物逆境因子胁迫的影响, 但其诱导表达模式不论在逆境因子种类还是在诱导时间上均存在着很大的差异, 这种基因诱导表达模式的差异可能体现于它们之间的生物学功能的差异.     

虫害诱导的水稻挥发物对褐飞虱寄主选择行为的影响

用固相微萃取（SPME）、Tenax-TA吸附剂法结合气相色谱（GC）以及气相色谱－质谱联用（GC－MS）等技术，从不同诱导处理水稻植株（机械损伤、褐飞虱危害（具刺吸式口器）、斜纹夜蛾危害（具咀嚼式口器）及健康植株中分离鉴定了16种挥发性物质，不同处理水稻挥发物化学成分与含量有明显差别，受斜纹夜蛾伤害的水稻，其挥发物的含量与种类最多，其次为受褐飞虱伤害3和5d的植株，健康植株、机械损伤植株以及受褐飞虱伤害1和2d的水稻植株的挥发物种类少且含量低，在双向选择实验中，褐飞虱对健康植株、机械损伤植株以及褐 飞虱危害植株的定向选择行为无显著差异，斜纹夜蛾诱导的水稻挥发物对褐飞虱具有明显的拒避作用。     

栽培稻的紧穗野生稻抗褐飞虱主效基因的遗传定位

野生稻资源是水稻育种中获取有利外源基因的一个主要来源。紧穗野生稻（Oryza eichingeri,2n=24,CC)原产于非洲，具有高抗褐飞虱、白背飞虱和白叶枯病等多种有利性状。在紧穗野生稻与栽培稻（Oryza sativa,2n=24,AA)品种02428远缘杂交后代中，利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP)和微卫星（simple sequence repeats,SSR) 等分子标记，对栽培稻背景下外源遗传物质的存在进行了跟踪鉴定，并对来自紧穗野生稻的抗褐飞虱基因进行了遗传分析和染色体定位。结果表明，紧穗野生稻的染色体片段已经易位到栽培稻中；抗褐飞虱性状由一对显性主效基因控制，位于第2染色体，在两个微卫星标记RM240和RM250之间，遗传距离分别为6．1和5．5cM，暂时定名为Bphl3(t)。该基因的发现和定位将有助于对水稻褐飞虱抗性的改良。     

水稻油体钙蛋白家族的进化及对干旱胁迫的响应性分析

油体钙蛋白不仅参与了油体的形成, 而且可能与植物耐受干旱胁迫有关. 目前对水稻中的油体钙蛋白的功能了解很少. 本文通过对水稻基因组数据库的序列搜索, 确定了水稻油体钙蛋白基因家族的6 个成员. 通过对这些基因的序列、结构和染色体位置分析, 表明水稻油体钙蛋白基因家族的扩增可能与片段复制和串联重复有关. 通过对这些基因与其他物种中的油体钙蛋白基因的系统进化分析及功能比较分析, 揭示了拟南芥和水稻中功能可能对应的成员. 为了确定与干旱胁迫响应相关的油体钙蛋白基因, 通过荧光定量PCR 检测了水稻油体钙蛋白家族在根、叶、花中的表达, 以及在这些组织中响应干旱胁迫的表达情况, 发现有3个基因成员在不同组织中受干旱胁迫的诱导, 为进一步对它们展开功能分析奠定了基础.     

大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析

WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族, 它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应, 还参与了生长发育及多种代谢途径的调控. 本研究构建了一个大豆cDNA文库, 采用酵母单杂交的方法, 用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选, 获得了GmWRKY57B基因, 该基因全长1033 bp, 编码299个氨基酸, 属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组; 酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明, GmWRKY57B能够与W-box特异性结合; 酵母体内的转录激活实验表明, GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能; GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达; GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性, 表明GmWRKY57B 基因在非生物逆境中有一定的功能.     

水稻低磷胁迫基因表达谱分析

磷是植物生长发育所需的大量营养元素之一, 当周围环境中磷缺乏时, 植物往往通过扩大根系范围来增加对土壤中磷的吸收, 同时调节一些生化代谢途径, 增加磷酸酶、有机酸等物质的分泌从而活化土壤中固定的难溶性磷. 本研究利用水稻全基因组寡核苷酸芯片对水稻中早18分别在正常营养条件和低磷胁迫处理条件下6, 24, 72 h 3个时间点的根部和地上部材料进行基因表达谱分析. 研究结果共鉴定出低磷胁迫差异表达基因1207个, 其中根部差异表达基因795个, 地上部差异表达基因450个, 根部和地上部共同出现的差异表达基因38个. 功能分析表明, 这些差异表达基因包括了代谢调节离子转运、信号传导、转录调节、和逆境应答等方面的基因. 同时发现水稻在低磷胁迫后大量转座子基因在转录水平上发生了变化. 这些研究结果为进一步揭示植物磷代谢调控机理的研究提供了有用的信息.     

水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

β-葡萄糖苷酶处理与褐飞虱为害激活水稻类似的信号转导途径

已有研究表明, β-葡萄糖苷酶处理植株能诱导其产生与植食性昆虫为害类似的挥发物, 然而其诱导产生的机理至今尚不明确. 水杨酸、茉莉酸、乙烯和过氧化氢是植物诱导防御反应中发挥重要作用的信号分子. 为此, 本文对β-葡萄糖苷酶处理后水稻体内这4种信号分子的含量进行了测定, 并与褐飞虱为害稻株进行了比较, 以明确β-葡萄糖苷酶处理与褐飞虱为害是否激活了水稻类似的信号转导途径. 结果表明, 与相应的对照相比, 机械损伤并经β-葡萄糖苷酶处理能明显提高水稻水杨酸、乙烯和过氧化氢的浓度, 但却降低了茉莉酸的含量. β-葡萄糖苷酶对这些信号分子含量影响的总体趋势与褐飞虱为害的基本一致, 尽管两者所诱导的信号分子的绝对含量与时间动态存在一定差异, 表明β-葡萄糖苷酶处理能激活与褐飞虱为害相类似的水稻信号转导途径. 这一结果可以用于解释为什么两种处理能诱导水稻产生类似的挥发物并对稻虱缨小蜂具有同等的引诱作用.     

小鼠RTN3基因mRNA和蛋白在小鼠中枢神经系统的分布模式

根据与人RTN3基因同源的小鼠EST AA237377设计筛库引物, 克隆得到小鼠RTN3 cDNA, 该cDNA长2814 bp, 含1个714 bp的可读框, 编码1个具237个氨基酸的蛋白. Northern杂交检测该基因在小鼠不同组织中的表达谱, 发现它有3个转录本, 分别为1.8, 2.8和4.2 kb, 其中1.8和2.8 kb的转录本存在于多种组织中, 2.8 kb的转录本在脑中的表达量最高, 4.2 kb的转录本仅在脑中存在. 用成年小鼠脑和脊髓切片进行原位杂交和免疫组织化学反应, 发现该基因在中枢神经系统的非胶质细胞中广泛表达, 且在某些区域表达较高, 如海马、大脑皮层、下丘脑及一些神经核团.