基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术

【目的】探索出一种蚊虫附肢(如单只足)微量DNA的提取方法,用于蚊虫分子鉴定和基因型研究。【方法】采用Chelex-100溶液和蛋白酶 K 结合的方法用于单只蚊虫足的微量 DNA 的提取。基于该方法,将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料,从中提取蚊虫基因组 DNA ;以之为模板,扩增核糖体 DNA 的 D2 , D3 , ITS2 区以及线粒体 COI 和COII 基因,并对 PCR 扩增产物进行测序。【结果】提取到了高质量的基因组DNA,PCR扩增获得了高质量的 DNA 扩增片段,进一步测序获得了高质量的序列。【结论】该方法价格便宜,操作简单方便,减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA 提取不影响对剩下的部分开展形态学等研究,可以作为蚊虫分子生物学研究中微量 DNA 样本提取的重要方法,也为其他昆虫微量 DNA 的提取提供理论依据。
     

叩甲科昆虫微量基因组DNA抽提方法的研究

叩甲科昆虫种类数量众多,分布广泛,很多种类都是重要的地下害虫。由于叩甲科昆虫外部形态相似度非常高,传统的形态分类工作具有较大的难度,对于叩甲科的系统发育研究大多基于分子标记进行展开。目前很多昆虫基因组的抽提方法会破坏整个虫体,为此,本研究改进了1种微量昆虫基因组DNA的抽提方法,采用蛋白酶K消化法,以叩甲昆虫的1条后足肌肉作为抽提对象,以期在不破坏叩甲主要鉴定特征的前提下,提取到较高质量的基因组DNA。同时,对提取到的基因组进行PCR扩增和测序,结果表明该方法抽提到的基因组DNA可以应用于分子学相关试验。由于该方法简单快速,故针对大批量样本抽提时可有效降低成本。     

用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA

旨在建立快速、大规模提取牦牛(Bos grunniens)肌肉中基因组DNA的方法.试验样品为冰冻保存的九龙牦牛背最长肌(n=10).采用两种取样方法(镊子取样和枪头取样)采集冰冻的肌肉样品,用Chelex-100方法提取其中的基因组DNA,并进行PCR扩增.结果显示,镊子取样和枪头取样提取的基因组DNA,均可用于两个核基因和一个线粒体基因的PCR扩增,但枪头取样简便易行,提取的DNA用PCR扩增细胞色素b,扩增35个循环数的PCR产物可直接测序.表明Chelex-100法可用于快速提取牦牛肌肉中基因组DNA,操作简单,成本低廉,适用于大规模提取组织中的DNA.     

果蝇基因组DNA的大规模提取及其RAPD-PCR反应条件的优化

介绍了一种大规模提取高质量果蝇基因组DNA的方法，该法不需液氮研磨，不需匀浆转移，不需高速离心，全部操作在3个1.5μL离心管中完成，所以特别适用于对不同果蝇品系等多样本的大规模提取，以本法提取的DNA为模板建立了RAPD－PCR分析的最佳反应体系，获得了稳定而理想的扩增效果，特别适用于小型昆虫的群体遗传多样性研究。     

青鳉DMY基因的克隆及其在性别鉴定中的应用

提取雄性青鳉成鱼基因组DNA为模板,利用特异性引物,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增获得1 908 bp的特异性条带.经测序证明为DMY基因片段,其核苷酸序列由3个外显子和2个内含子组成,可连续编码150个氨基酸.建立准确而有效的鉴定任意发育阶段青鳉个体雌雄性别基因型的方法,即利用管家基因——肌动蛋白基因PCR扩增条带的有无验证DNA样本提取和PCR扩增的有效性,同时利用雄性DMY基因的PCR扩增条带的有无鉴定青鳉个体的雌雄性别.对随机选取的成鱼和新生鱼卵样本,应用该方法可成功地鉴定出青鳉个体的雌雄性别.     

PCR-RFLP中Chelex-100制备DNA模板的方法建立及其条件优化

目的:建立一种快速、可靠、经济的DNA纯化技术用于分子流行病学调查及群体遗传学的研究.方法:根据MMP3基因外显子2中rs679620的SNP区域(-Lys45Glu-)设计引物,采用Chelex-100法从微量全血中提取人基因组DNA,利用PCR-RFLP对其进行检测,观察基因分型结果.结果表明:取10μL全血,加入200μL 5%Chehx-100溶液,56℃水浴保温30 min后,100℃水浴8 min,离心取上清为最佳用于PCR的DNA模板提取条件.经PCR扩增及酶切验证,其DNA条带特异、清晰,适用于基因分型.结论:提取人基因组DNA的Chelex-100法所需血样微量、操作简单,快速、可靠、经济,特别适合于大量样本的DNA提取,可用于人群分子流行病学调查及群体遗传学的研究.     

羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物高效分离基因组DNA

分别以常量的大肠杆菌和微量的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)为实验对象,研究羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物载体对基因组DNA的分离纯化,对分离的大肠杆菌基因组DNA直接采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析,分离的A.ferrooxidans基因组DNA则直接作为硫化物质体醌氧化还原酶基因片断的PCR扩增模板.研究结果表明:采用磁性纳米复合物法,其制备DNA的时间是传统方法的1/3,具有快速、简单的优点,在微量样品DNA提取中,由于其富集提取DNA,并提高了PCR的灵敏性功能,比传统方法优越,可用于食品卫生致病微生物的检测、法医鉴定以及极难培养的微生物的菌种鉴定.     

不同类型DNA提取试剂盒提取牦牛乳粉DNA效果的比较

以牦牛乳粉为材料,采用了细胞/组织/血液基因组提取试剂盒、植物基因组提取试剂盒及食物核酸提取试剂盒3种不同类型的DNA提取试剂盒提取牦牛乳粉的基因组DNA,使用核酸和蛋白质分析仪检测后表明3种提取方法获得的DNA浓度相近;使用牦牛线粒体中细胞色素b的DNA序列特异性探针引物对所得的3种DNA进行实时荧光PCR,都获得了特异性扩增。结果表明3种类型的DNA提取试剂盒提取的牦牛乳粉基因组DNA都可以用于牦牛乳粉的分子特异性研究,综合提取操作的难易程度、耗时长短、成本高低及提取DNA的浓度分析,细胞/组织/血液基因组提取试剂盒为最佳选择。但食物核酸提取试剂盒的提取步骤简单,消解更彻底,更适用于一次性提取较多样本的基因组DNA。     

甲醛溶液保存的中华哲水蚤基因组DNA提取和PCR扩增

提取了保存于5％甲醛溶液中的单只中华哲水蚤基因组DNA．经凝胶电泳后虽无清晰条带．但PCR扩增后可得线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(mtCOI)片段．测序分析，该片段长度为710bp。与GenBank中的序列(索引号AF332769)比对后确定为中华哲水蚤mtCOI序列的一部分．利用本实验方法所提取的基因组DNA可适用于系统发生、种群遗传结构等领域的分子水平研究．为保存在甲醛溶液中的小型海洋浮游动物的基因信息利用提供实用技术。     

用改进的CTAB法提取肉苁蓉基因组DNA

研究了肉苁蓉(Cistanche deserticola)基因组DNA的分离提取方法.由于肉苁蓉组织内含有大量的多糖类及蛋白等物质,严重干扰DNA的抽提,在对其进行若干预处理之后,采用改进的CTAB法提取基因组DNA.根据外观、琼脂糖凝胶电泳检测、D260/D280的测定和PCR扩增表明,用改进的CTAB法提取肉苁蓉基因组DNA,所得DNA无论是纯度还是完整性都比较好,可以直接用于RAPD反应体系.     

三种血液基因组 DNA 提取方法的比较研究

摘要: 目的 比较采用 3 种不同 DNA 提取方法提取豚鼠血液基因组 DNA 之间的差异。方法 分别用新鲜抗凝血 NaI 手提法、血凝块手提法和试剂盒 DNA 提取法提取 20 只豚鼠血液基因组 DNA,用分光光度计测定、琼脂糖凝胶 电泳、PCR 扩增等方法对提取的 DNA 片段的完整性、浓度、纯度和用于 PCR 扩增的效果等方面进行比较研究。结 果 新鲜抗凝血 NaI 手提法提取的 DNA 完整性、浓度和纯度均为最高; 血凝块法提取的 DNA 浓度和抗凝血提取的 DNA 浓度接近但纯度最低,有一定程度的断裂和降解; 试剂盒法提取的 DNA 浓度最低,纯度和完整性处于中间,但 三种方法提取的 DNA 都可用于 PCR 扩增反应。结论 3 种方法都可以提取基因组 DNA 并且所提取的 DNA 均能 满足后续 PCR 扩增实验的要求,但每种方法各有利弊,可根据具体的条件选择适宜的方法。     

一种快速制备毕赤酵母表达系统P CR鉴定模板DNA的方法

文章研究了简便高效获取毕赤酵母表达系统PCR鉴定模板DNA的提取方法,采用酶消化和物理冻熔结合的方法,提取的酵母基因组DNA直接PCR扩增检测质量。结果表明,该方法提取酵母基因组DNA具有质量高、成本低、耗时短、操作简单等优点。     

活性污泥基因组DNA快速提取新方法及其指纹分析

建立了从活性污泥中快速提取基因组DNA的新方法，过程包括粗提与精制两个步骤，简化了繁琐的提取程序，提高了提取效率．用该方法提取的基因组DNA做模板，进行扩增核糖体限制性酶切片断分析（ARDRA）及核糖体基因间区序列分析（RISA），均获得了理想的多态性指纹图谱；采用两对特异性引物（鞘氨醇单胞菌属和氨加氧酶基因）对所提污泥基因组DNA进行扩增，均获得了正确的PCR产物．该方法提取的污泥基因组DNA不但适用于研究污泥系统中菌群多样性分析，而且还可以对特定基因进行跟踪监测。     

激光捕获显微切割结合低体积扩增技术研究

目的:研究激光捕获显微切割技术联合应用低体积扩增技术,建立一套微量混合样本DNA的检验方法。方法:使用PALM系统切割捕获目标细胞,弹射到低体积扩增玻片的反应位点上,消化细胞,提取DNA,使用Identifiler?试剂盒在1.5μL体系中进行PCR扩增。结果:分别捕获10个口腔上皮细胞、20个精子细胞,成功获得16个完整的STR基因座分型谱带。结论:激光捕获显微切割技术联合应用低体积扩增技术适用于法医学中微量混合样本DNA检验。     

糯米酒发酵过程中微生物基因组提取方法比较

为了更加快速地获得糯米酒发酵过程中高质量的微生物基因组DNA,本实验通过测定基因组DNA浓度和进行聚合酶链式反应(PCR),利用溶菌酶-SDS-蛋白酶-K(A法),改良CTAB(B法)和改良CTAB-溶菌酶(C法)三种实验方法获得微生物基因组DNA,通过比较三种方法发现,C法提取效率最高,获得的基因组DNA浓度为1 573.97±711.51ng/μL;B法获得的基因组浓度为1 436.03±128.0ng/μL;A法效率最低,获得基因组浓度为411.67±133.29ng/μL.以基因组DNA为模板进行PCR,将扩增产物在0.6%琼脂糖凝胶中进行电泳检验.结果显示C法获得的条带最清楚明亮,表明DNA浓度最高、结构完整.基因组DNA浓度和PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带的亮度表明,提取糯米酒发酵过程中微生物基因组DNA的最优方法为改良CTAB-溶菌酶法(C法).     

从微量血中快速制备线粒体DNA片段

目的　建立并鉴定用于从微量血中快速制备线粒体DNA片段的技术 .方法　采用微量血样品 ,改进提取线粒体DNA的方法 ;以不同的方法提取的血DNA为模板 ,同时扩增nDNA上的基因片段和mtDNA上的基因片段 ,PCR相对定量分析比较各种方法提取的mtDNA片段的纯度 ;结果　用华美公司生产的ReadyPCR(tm)微量全血DNA纯化系统和作者的方法都得到了mtDNA ,而用作者的方法获得的mtDNA的纯度较高 ;结论　由于线粒体DNA与核DNA存在有同源片段 ,ReadyPCR(tm)微量全血DNA纯化系统和常规酶解法提取DNA不适合用于对mtDNA的鉴定 ,作者的方法简便快捷地排除了核DNA的污染 ,非常适合于对mtDNA进行PCR分析 .     

基于RAD-seq技术的鹅掌楸基因组SNP标记开发

【目的】开发大量可靠的SNP标记,为鹅掌楸高密度遗传连锁图谱的构建和基于基因组的林木选择育种提供分子基础。【方法】从北美鹅掌楸NK基因型为母本、鹅掌楸LS基因型为父本的F1代杂交群体中,选取198株个体为作图群体。用限制性内切酶EcoR I对包括2个亲本和198个子代在内的200个单株的基因组DNA进行酶切,构建RAD(restriction-site associated DNA)文库并进行RAD-seq测序。采用读长为91 bp的双末端测序。2个亲本的平均测序深度为2×,198个子代的平均测序深度为0.8×,平均产量为1.94 Gb,共获得约387.21 Gb数据。用Stacks软件将每个样品的RAD-reads作生物信息学分析,对候选位点进行卡方检验和缺失率检验,再将符合孟德尔遗传的标记及与之相对应的RAD-tag序列和鹅掌楸参考基因组序列进行比对。最后,从本研究开发的SNP标记中选取27个候选SNP位点,设计引物,对随机挑选的16个F1代进行PCR扩增并将结果进行测序,同时验证SNP的有效性。【结果】从候选群体中共鉴定到22 019个SNP位点,符合孟德尔遗传规律的标记为4 233个,最终获得3 501个候选SNP标记。SNP验证中,共有293个SNP标记完成测序并能判读结果,所有位点都为SNP位点,共有194(66.2%)个SNP变异类型得到了验证。 【结论】基于RAD-seq技术和鹅掌楸参考基因组序列为基础的策略,能够作为一种快速有效的手段,实现大规模的分子标记开发,可用于鹅掌楸等林木的高密度遗传图谱的构建。     

单只大型溞DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析

利用基因组DNA纯化试剂盒稳定、快捷地提取单只大型溞（Daphnia magna）基因组DNA.以提取出的DNA为模板,利用线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（COI）特异性引物,通过降落PCR技术扩增大型溞COI部分基因的序列.序列分析表明,此基因确为大型溞COI部分基因片段,从而证明本研究所提取的线粒体DNA能够为进一步开展大型溞的种群遗传学研究、物种间的亲缘关系和系统进化及种质资源管理与保护等提供物质基础.     

黄连木叶片基因组DNA提取方法

黄连木叶片中酚类化合物、色素、多糖和其它次生代谢物质含量较高,这给黄连木基因组DNA提取带来困难。为了从黄连木叶片中提取高质量基因组DNA,本文运用CTAB法和改良CTAB法提取黄连木基因组DNA,通过定性、定量及PCR分析检测所提取DNA的质量。结果表明:改良CTAB法提取的DNA电泳条带清晰无RNA等污染,OD260和OD280比值在1.8左右,RAPD扩增条带清晰、无弥散现象、亮度均一。说明改良CTAB法提取的DNA纯度较高,适用于PCR扩增反应。     

硅胶破碎法抽提真菌染色体DNA

在进行基因组步行PCR克隆真菌木聚糖酶基因的研究中,探索并建立了一套可在普通分子生物学实验室采用的高得率、高质量真菌染色体DNA的抽提方法.采用液氮研磨和硅胶破碎相结合提高染色体DNA得率,采用亚精胺法纯化提高DNA的纯度.抽提的染色体DNA用琼脂糖凝胶电泳、限制酶切、PCR反应及紫外吸收光谱等方法进行了鉴定,结果显示此方法可以获得分子量大、样品纯的染色体DNA,可有效地用于PCR扩增,并能被限制酶有效地消化.