黑斑蛙线粒体DNA提取与纯化的研究

用碱变性法和核酸酶消化法从黑斑蛙的肝脏和肌肉中提取和纯化线粒体DNA,经琼脂糖凝胶电泳及OD值测定显示,所得黑斑蛙线粒体DNA的结构完整,并避免了核DNA、线粒体RNA、蛋白质、有机溶剂等的污染.结果表明:黑斑蛙mtDNA的分子量大小约为17.167kb.其得率和纯度均能满足mtDNA的各种分析要求.     

PCR-RFLP中Chelex-100制备DNA模板的方法建立及其条件优化

目的:建立一种快速、可靠、经济的DNA纯化技术用于分子流行病学调查及群体遗传学的研究.方法:根据MMP3基因外显子2中rs679620的SNP区域(-Lys45Glu-)设计引物,采用Chelex-100法从微量全血中提取人基因组DNA,利用PCR-RFLP对其进行检测,观察基因分型结果.结果表明:取10μL全血,加入200μL 5%Chehx-100溶液,56℃水浴保温30 min后,100℃水浴8 min,离心取上清为最佳用于PCR的DNA模板提取条件.经PCR扩增及酶切验证,其DNA条带特异、清晰,适用于基因分型.结论:提取人基因组DNA的Chelex-100法所需血样微量、操作简单,快速、可靠、经济,特别适合于大量样本的DNA提取,可用于人群分子流行病学调查及群体遗传学的研究.     

基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术

【目的】探索出一种蚊虫附肢(如单只足)微量DNA的提取方法,用于蚊虫分子鉴定和基因型研究。【方法】采用Chelex-100溶液和蛋白酶 K 结合的方法用于单只蚊虫足的微量 DNA 的提取。基于该方法,将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料,从中提取蚊虫基因组 DNA ;以之为模板,扩增核糖体 DNA 的 D2 , D3 , ITS2 区以及线粒体 COI 和COII 基因,并对 PCR 扩增产物进行测序。【结果】提取到了高质量的基因组DNA,PCR扩增获得了高质量的 DNA 扩增片段,进一步测序获得了高质量的序列。【结论】该方法价格便宜,操作简单方便,减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA 提取不影响对剩下的部分开展形态学等研究,可以作为蚊虫分子生物学研究中微量 DNA 样本提取的重要方法,也为其他昆虫微量 DNA 的提取提供理论依据。
     

三种血液基因组 DNA 提取方法的比较研究

摘要: 目的 比较采用 3 种不同 DNA 提取方法提取豚鼠血液基因组 DNA 之间的差异。方法 分别用新鲜抗凝血 NaI 手提法、血凝块手提法和试剂盒 DNA 提取法提取 20 只豚鼠血液基因组 DNA,用分光光度计测定、琼脂糖凝胶 电泳、PCR 扩增等方法对提取的 DNA 片段的完整性、浓度、纯度和用于 PCR 扩增的效果等方面进行比较研究。结 果 新鲜抗凝血 NaI 手提法提取的 DNA 完整性、浓度和纯度均为最高; 血凝块法提取的 DNA 浓度和抗凝血提取的 DNA 浓度接近但纯度最低,有一定程度的断裂和降解; 试剂盒法提取的 DNA 浓度最低,纯度和完整性处于中间,但 三种方法提取的 DNA 都可用于 PCR 扩增反应。结论 3 种方法都可以提取基因组 DNA 并且所提取的 DNA 均能 满足后续 PCR 扩增实验的要求,但每种方法各有利弊,可根据具体的条件选择适宜的方法。     

白蚁mtDNA提取方法改良及检测

利用mtDNA多态性进行种类鉴定是一种分子生物学常用方法,从DNA水平对白蚁进行物种鉴别并探讨物种的进化,其必要前提是提取到一定数量和质量的mtDNA．在分离得到线粒体后,分别采用CTAB、SDS2种方法提取mtDNA．紫外分光光度计检~I]DNA纯度及浓度,用mtDNA特异性引物进行PCR扩增检测．试验证明2种方法均能成功提取白蚁的mtDNA,SDS法提取效果较好．     

从土壤中快速提取纯化DNA方法的建立

比较了从土壤中提取及纯化DNA的不同方法,确立了TENS-乙酸铵提取方法和PVPP柱层析的纯化方法.结果显示:TENS-乙酸铵提取方法对不同土壤均有较好的提取效果,DNA片段长度在23.1 kb以上,且无明显降解;PVPP柱层析的纯化方法比胶回收纯化方法的DNA回收效率高、质量好,可用于PCR扩增.     

单只大型溞DNA的提取及其COI基因部分序列测定分析

利用基因组DNA纯化试剂盒稳定、快捷地提取单只大型溞（Daphnia magna）基因组DNA.以提取出的DNA为模板,利用线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（COI）特异性引物,通过降落PCR技术扩增大型溞COI部分基因的序列.序列分析表明,此基因确为大型溞COI部分基因片段,从而证明本研究所提取的线粒体DNA能够为进一步开展大型溞的种群遗传学研究、物种间的亲缘关系和系统进化及种质资源管理与保护等提供物质基础.     

栽培参及其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究

目的探讨人参及其伪品的基因组特异性片段特征,建立人参与伪品的脱氧核糖核酸(DNA)指纹鉴定方法.方法采用CTAB-SDS结合法提取人参及伪品基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA纯度,设计特异性引物,并使用该引物对人参及其伪品DNA进行PCR扩增.结果人参与伪品提取出的基因组DNA大于23 kb,其纯度为1.70±0.19,并且人参能扩增出194 bp大小的片段,而其伪品未能扩增出相应片段.结论人参DNA片段具有特异性指纹特征,可作为人参与其伪品鉴定的有效方法,方法简便,结果可靠.     

线粒体假基因--核基因组中的分子化石

核基因组中线粒体DNA片段是线粒体基因向核基因组转移造成的．这些线粒体来源的核DNA片段都是不能表达的假基因，这种序列容易被通用引物从总DNA模板中优先扩增出来，它的存在必然给mtDNA的应用带来负面影响．总结了脊椎动物线粒体假基因的特点，结合笔在GenBank上发现的登录为mtDNA而实际为假基因的序列提出假基因存在的普遍性，分析这种序列对mtDNA在人类线粒体病理学、脊椎动物系统进化研究等方面应用的负面影响．对假基因在线粒体和细胞核两基因组进化研究以及物种系统发育学研究中的应用前景进行展望．     

用Chelex-100方法从牦牛乳中提取总DNA扩增线粒体DNA序列

旨在建立一种从牦牛乳中快速提取总DNA并扩增线粒体基因的方法.实验以20头麦洼牦牛的乳为试验材料,用Chelex-100方法提取总DNA,扩增线粒体DNA(mtDNA)的D-loop区和细胞色素b基因(Cytb).结果显示,Chelex-100法能利用20μL全乳或脱脂乳快速制备总DNA,用于mtDNA的D-loop区和Cytb基因的PCR扩增,条带清晰并能直接测序.该方法的PCR扩增一般需要45个循环,扩增效果存在一定的个体差异,且全乳优于脱脂乳,半奶牦牛乳优于全奶牦牛乳.建立的方法既可使用全乳,也可采用脱脂乳大规模提取总DNA,并扩增线粒体基因用于后续研究.     

基于Chelex-100和蛋白酶K的蚊虫足样本DNA提取技术

【目的】探索出一种蚊虫附肢(如单只足)微量DNA的提取方法,用于蚊虫分子鉴定和基因型研究。【方法】采用Chelex-100溶液和蛋白酶K结合的方法用于单只蚊虫足的微量DNA的提取。基于该方法,将不同方法保存的不同蚊种的足作为实验材料,从中提取蚊虫基因组DNA;以之为模板,扩增核糖体DNA的D2,D3,ITS2区以及线粒体COI和COII基因,并对PCR扩增产物进行测序。【结果】提取到了高质量的基因组DNA,PCR扩增获得了高质量的DNA扩增片段,进一步测序获得了高质量的序列。【结论】该方法价格便宜,操作简单方便,减少了对蚊虫样本的依赖。单只足用于DNA提取不影响对剩下的部分开展形态学等研究,可以作为蚊虫分子生物学研究中微量DNA样本提取的重要方法,也为其他昆虫微量DNA的提取提供理论依据。     

一种四膜虫线粒体DNA提取的新方法

本文根据四膜虫线粒体DNA（mtDNA）对碱稳定这一特性，建立了一种更为简便的，能直接提取四膜虫线粒体DNA的方法。该方法快速简便，重复性好，可用于游离细胞材料mtDNA的提取。     

内蒙古荒漠草原土壤微生物DNA提取方法的研究

利用三种提取方法从内蒙古荒漠草原土壤样品中提取了土壤微生物DNA,得到的DNA片段长度在23 kb以上,提取效果较好无降解.采用试剂盒直接纯化、凝胶回收试剂盒纯化、玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化这三种方法对粗提液进行纯化,结果显示:凝胶回收试剂盒纯化后DNA纯度最高,试剂盒直接纯化可得到较纯的DNA,而玻璃珠DNA回收试剂盒SK1111 DNA纯化的效果不佳,不宜进行后续的PCR扩增.以纯化的土壤微生物DNA为模板扩增了细菌16SrDNA,扩增产物分子量为1.5kb左右.通过比较研究提出了一种适合于从荒漠草原土壤中进行微生物DNA提取、纯化及PCR扩增的有效方法.     

海洋底泥环境DNA提取与纯化方法比较研究

为了探索有效的海洋底泥宏基因组DNA提取与纯化方法,分别采用CTAB结合SDS法、CTAB结合玻璃珠法、SDS结合蛋白酶K法和SoilMasterTM试剂盒法提取海洋底泥宏基因组DNA,用柱式腐殖酸清除试剂盒法与电洗脱法纯化宏基因组DNA,并对宏基因组DNA的产量与纯度进行评价.结果表明:SDS结合蛋白酶K法提取率最高,DNA片段完整;SoilMasterTM试剂盒法与CTAB结合SDS法次之;CTAB结合玻璃珠法有严重降解;电洗脱法可以得到高纯度、大于42kb宏基因组DNA片段.因此,SDS结合蛋白酶K法和电洗脱法提取纯化海洋近海底泥宏基因组DNA优于其他方法.     

茄子雄性不育株和可育株的胞质DNA和核DNA差异分析

以茄子(Solanum melongenaL)雄性不育株“正兴1号”(S)和可育株(F)的总DNA为模板,对60个随机引物进行了筛选,找到5个其RAPD(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)扩增产物在茄子雄性不育系和对照材料间存在稳定差异的引物．将该5个引物同时扩增总DNA、核DNA和线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)．以总DNA为模板时得到多态性片段9个,以核DNA为模板时得到5个,以mtDNA为模板时得到9个．以总DNA为模板时得到的9个扩增片段中,有5个在总DNA和mtDNA中同时出现,而在核中没有出现,即认为来自mtDNA,这5个片段中,有4个来自可育株,1个来自不育株,说明不育株和可育株在mtDNA上存在差异;有4个片段同时出现在以总DNA和核DNA为模板的扩增中,但在以mtDNA为模板的扩增中却没有出现,认为是来自核DNA,这4个片段中,有3个来自不育株,一个来自可育株,说明可育株和不育株在核DNA上也存在差异．结果初步表明：新发现的茄子雄性不育可能是核质相互作用所引起．     

硅胶破碎法抽提真菌染色体DNA

在进行基因组步行PCR克隆真菌木聚糖酶基因的研究中,探索并建立了一套可在普通分子生物学实验室采用的高得率、高质量真菌染色体DNA的抽提方法.采用液氮研磨和硅胶破碎相结合提高染色体DNA得率,采用亚精胺法纯化提高DNA的纯度.抽提的染色体DNA用琼脂糖凝胶电泳、限制酶切、PCR反应及紫外吸收光谱等方法进行了鉴定,结果显示此方法可以获得分子量大、样品纯的染色体DNA,可有效地用于PCR扩增,并能被限制酶有效地消化.     

凡纳滨对虾线粒体DNA COI基因片段序列

以相应引物对凡纳滨对虾（Lito penaeus vannamei）线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（mtDNA CO I）进行PCR扩增，经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序，得到709bp的碱基片段．碱基组成A、C、G、T含量分别为198bp（27．93％）、136bp（19．18％）、129bp（18．19％）、246bp（34．70％）．与果蝇（Drosophilayakuba）的mtDNA CO I全序列比对。经分析发现：本实验获得的凡纳滨对虾mt CO I基因片段序列和Gen Bank上的同种序列（AY264901）都只是基因序列的一部分，二者之间有41bp的重叠并可拼接，拼接后的总长为1515bp．证明本实验条件下获得的mtCO I基因片段确实来自凡纳滨对虾线粒体DNA，且本实验所用引物具有通用性．     

鸟类陈旧标本DNA提取方法的研究

应用3种DNA提取方法(蛋白酶K法, Chelex 100法, 硅颗粒法),从馆藏湿地鸟类陈旧标本的羽毛、皮肤、骨骼组织中提取基因组DNA,经PCR扩增后对线粒体12S rDNA部分片段进行测序和Genbank查对,以探讨鸟类陈旧标本DNA的最佳提取方法和提取组织.结果表明,利用鸟类陈旧标本能够提取到基因组DNA.蛋白酶K法和硅颗粒法能够从白鹭(Egretta garzetta)标本的骨骼组织中提取到DNA并获得长度425 bp的线粒体12S rDNA序列(Genbank接收号AY766387),蛋白酶K法还能够从白鹳(Ciconia ciconia)标本的羽毛中获得长度263 bp的线粒体12S rDNA序列(Genbank接收号AY766388),Chelex 100法不能从鸟类标本中提取到DNA.蛋白酶K法的DNA提取量较大,但是步骤繁琐而导致DNA被污染的几率增大,因此,实验过程中要注意防止污染,且提取骨组织DNA要经过纯化.硅颗粒法的步骤简单,污染几率降低,提取骨骼组织DNA不需经过纯化,但是其DNA提取量较少,不能用于羽毛DNA的提取.因此,硅颗粒法是从鸟类陈旧标本骨骼组织提取DNA的理想方法,蛋白酶K法可用于鸟类陈旧标本羽毛的DNA提取.     

AFM观察小白鼠心肌和肝核DNA片段的基因移位

用原子力显微镜(简称AFM)直接观察、体外表达和体外转录等实验技术组合,观察到了心肌和肝的核DNA片段的基因;用磷酸缓冲液稀释,并用开关蛋白质等活性因子使其部分解离,促使核基因在核DNA片段内或核DNA片段间静态或动态移位,得到了对应核DNA片段中的相关基因,如LDH/DNA体外表达活性变化的LDH同功酶酶谱图。基因静态或动态移位均表达活性降低,且基因移位程度与其对应基因活性降低程度呈正相关性。展示了未来运用AFM和体外表达等实验技术组合研究核DNA片段的基因移位和对应基因突变机制的前景。     

曲霉属产毒真菌DNA的制备及其毒素相关基因aflR的PCR 检测

 研究了用改良的CTAB 法提取曲霉属产毒真菌DNA 的方法,并与试剂盒提取法进行比较。经过改良的CTAB 法能够成功提取出曲霉属产毒真菌的DNA,且浓度和纯度均可达到PCR 扩增的标准。根据合成黄曲霉毒素的aflR 基因设计两对引物,运用PCR 方法进行扩增鉴定,结果表明黄曲霉、寄生曲霉和溜曲霉基因中可检出aflR 基因,烟曲霉和杂色曲霉中并未检出,达到对黄曲霉毒素产生菌进行鉴定的目的。这种方法可为产毒真菌的快速检测提供参考。