豌豆中抗寒相关性miRNAs功能特异性验证及其克隆的研究

以正常(对照)和寒冷诱导豌豆(Pisumsativum Linn)幼苗为研究对象,用已知模式植物拟南芥中抗寒性相关的4种miRNAs序列(miR319、miR393、miR397、miR402)设计引物,通过半定量PCR法,检测在豌豆中正常条件和寒冷诱导下可能出现的相关miRNAs.在此基础上,选取模式植物中已知的miR319序列,设计特异引物,寻找豌豆抗寒性相关的miRNAs.结果表明:miR319、miR393、miR397、miR402均存在于豌豆中,并且冷处理诱导下表达量都有所上升,此结果验证了抗寒性miR家族在植物间存在保守性的特点;特异性寻找克隆、测序结果表明,新的与抗寒性相关的miRNAs也存在于豌豆中.本研究建立的寻找或验证miRNAs的方法是可行的,并为在各种生物中miRNAs功能研究与应用打下良好基础.     

美洲鲎miRNA的生物信息学挖掘与分析

利用miRBase数据库中已有动物的小RNA（miRNA）,通过生物信息学方法对美洲鲎(Limulus polyphemus)表达序列标签（Expressed Sequences Tag,EST）和cDNA进行序列比对,挖掘美洲鲎miRNA,得到了 72个miRNA前体(pre-miRNA)、49个可编码成熟miRNA,隶属于40个miRNA家族。miRNA家族归类结果表明,无论在低等脊椎动物还是高等动物中,miRNA家族的存在都是相当保守的。以miR-10基因前体为例,分析其序列与其他物种同源序列的差异,显示miRNA序列的高度保守性。miR-10前体序列分析系统进化发现,物种聚类与传统分类亲缘关系一致。     

miR-430基因簇的生物信息学分析

很多microRNA （miRNA）基因在基因组上紧密排列形成miRNA基因簇,mir-430是目前已发现的最大miR-NA基因簇,但其起源和进化方面却是未知的.为了揭示mir-430基因簇的起源及其在相关物种的进化关系,文中基于miRNA序列同源保守的特点,采用BLAST程序在NCBI基因数据库中搜索mir-430序列,在14个物种中共搜索到35个mir-430基因序列,这14个物种都为硬骨鱼类.多序列对比发现mir-430基因簇成熟序列的第2到第8位碱基以及第16到第22位碱基为保守序列.进化分析表明七鳃鳗的pma-mir-430基因可能是此基因家族最早出现的基因形式,并且pma-mir-430e可能是其他物种mir-430基因的祖先基因.祖先基因经过个别碱基的缺失及突变、串联重复和大片段重复等方式形成了mir-430基因簇.该研究通过分析不同物种中mir-430基因簇的特征,揭示mir-430基因簇的分子进化规律,为其调控网络和功能研究提供理论基础.     

大黄鱼转录组水平miRNA的生物信息学分析

根据成熟miRNA序列在物种间高度保守的特性,miRNA前体可以形成茎环状的二级结构,以及miRNA非编码的特性,搭建出了miRNA挖掘的生物信息学流程,并利用此流程在大黄鱼全转录组中进行miRNA的挖掘,得到54条成熟miRNA序列以及54条前体序列(pre-miRNA),根据其种子区的序列将其归为29个miRNA家族。通过对预测得到的miRNA前体序列同其他物种中相同家族的miRNA前体序列构建系统进化树,揭示出同一家族的miRNA前体在不同物种之间的保守性和多样性。利用两种靶基因预测软件,对成熟miRNA进行靶基因预测,共得到2360个靶基因,并对这些靶基因使用BLAST2GO做了进一步的GO注释和富集分析。     

应用生物信息学寻找大鼠中新的microRNA分子及其实验验证

大鼠已公布的microRNA(miRNA) 数量明显少于小鼠及人miRNA的数量.本文采用同源搜索的计算方法预测大鼠新的miRNA.从miRBase数据库中下载已知动物的pre- miRNAs, 在UCSC数据库中对大鼠的全基因组序列进行了Blat分析,并根据miRNAs的筛选标准,获得45条新的大鼠miRNAs;随后随机选取其中的9条新miRNAs进行RT- PCR实验验证,发现大部分miRNAs在脑、心、肺、肾、肌肉、脾、睾丸和肝8种组织中均有表达.在此基础上,对预测的新miRNAs进行了miRNA成簇分析和miRNA基因家族分析.     

大豆降解组文库microRNAs的启动子分析

研究目的：创新要点：通过分析miRNA的核心启动子和顺式作用元件为进一步解析大豆（Glycinemax）miRNAs表达调控及其功能研究提供重要信息。利用生物信息学方法全面解析了大豆降解组文库miRNA的启动子特征,并依据顺式作用元件及靶基因构建了miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之问存在潜在的负反馈调控网络。研究方法：本研究利用TSSP程序和PlantCARE数据库预测了来自大豆降解组文库的440个miRNA的核心启动子以及369个miRNAs的顺式作用元件,并依据顺式作用元件及靶基因构建miRNA调控网络。重要结论：83．86％的miRNA在其上游序列中含有启动子,8．64％的miRNA在其下游序列中含有启动子,21．59％的miRNA包含增强子。核心启动子的TATA盒与转录起始位点（TSSs）的分布相似（见图2）。此外,对转录起始位点5’端的顺式作用元件预测为miRNAs的可能功能和表达的时空性提供了线索。miRNAs的顺式作用元件和靶基因的分析显示,部分miRNA的表达与生长素响应因子、赤霉素响应因子之间存在潜在的负反馈调控（见图3）。     

基于叶绿体基因组序列对50种菊科植物亲缘关系分析

菊科为双子叶植物纲的第一大科,其科内等级划分和系统学研究存在巨大挑战。叶绿体基因组具有高度的保守性和较慢的进化速率,其在植物系统发育和物种进化研究中应用广泛。对菊科20个属50种植物叶绿体基因组序列进行亲缘关系分析,基于叶绿体基因组编码序列(coding sequence, CDS)、rbcL基因序列、rbcL+matK基因序列分别构建系统发育树,并对其中8个物种进行密码子偏好性分析和IR(Inverted Repeat)边界分析。比较3种方法构建的系统发育树,发现利用单个基因序列或两个基因序列构建的系统发育树与CDS序列构建的系统发育树在属间结果不一致,且CDS构建的系统发育树自展支持率高于其余两种,表明基于单基因序列或基因串联序列适用于属内物种的研究,而CDS序列适用于属间物种的研究。密码子偏好性研究显示选取的8个物种都对A/U结尾的密码子有偏好性。边界序列分析结果显示4个物种菊科植物的IR边界序列ycfI基因有缺失。研究结果为菊科植物的遗传进化和系统发育研究提供了理论支撑。     

盐生杜氏藻核糖体蛋白L38部分cDNA的克隆及分析

从盐生杜氏藻(Dunaliella salina)中，克隆到L38蛋白的部分cDNA序列及完整的CDS，由生物信息学分析发现与L38家族其它成员高度同源，证明该家族在进化上的高度保守性，为研究真核生物核糖体蛋白的重要补充．     

扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及序列特征分析

采用cDNA 末端快速扩增( rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫（Euplotes vannus）GPx cDNA特征进行分析. 克隆到扇形游仆虫GPx cDNA全长序列为672bp,该序列编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,且具有一定的保守性,含有3个催化残基和3个特征性基序．氨基酸序列进化分析结果表明,扇形游仆虫与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近,研究结果为扇形游仆虫GPx在生态毒理学的应用提供基础信息．     

黑斑蛙Dmrt4基因的克隆测序

Dmrt基因家族是新近发现的一个与性别决定相关的基因家族.该家族成员都含有一个新的具有DNA结合能力的保守基序--DM结构域,它们在性别决定和分化发育的调控中担负重要的功能.本文采用简并PCR技术,扩增并克隆了黑斑蛙基因组中的DM结构域,经序列分析,获得了Dmrt家族的一个成员rnDmrt4.通过对不同进化地位的物种进行Dmrt4基因的氨基酸序列聚类,发现了Dmrt4基因在系统进化中具有高度保守性,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用.     

A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion

MicroRNAs (miRNAs) constitute a growing class of non-coding RNAs that are thought to regulate gene expression by translational repression. Several miRNAs in animals exhibit tissue-specific or developmental-stage-specific expression, indicating that they could play important roles in many biological processes. To study the role of miRNAs in pancreatic endocrine cells we cloned and identified a novel, evolutionarily conserved and islet-specific miRNA (miR-375). Here we show that overexpression of miR-375 suppressed glucose-induced insulin secretion, and conversely, inhibition of endogenous miR-375 function enhanced insulin secretion. The mechanism by which secretion is modified by miR-375 is independent of changes in glucose metabolism or intracellular Ca2+-signalling but correlated with a direct effect on insulin exocytosis. Myotrophin (Mtpn) was predicted to be and validated as a target of miR-375. Inhibition of Mtpn by small interfering (si)RNA mimicked the effects of miR-375 on glucose-stimulated insulin secretion and exocytosis. Thus, miR-375 is a regulator of insulin secretion and may thereby constitute a novel pharmacological target for the treatment of diabetes.     

适冷菌Pseudomonas extremaustralis PF中海藻糖的合成途径及TreS基因的克隆

通过对一株高寒冰缘植物内生适冷假单胞菌Pseudomonas extremaustralis PF的研究,发现该菌中同时存在TPS/TPP,TreY/TreZ和neS三种海藻糖合成途径,其中TreS途径的合成酶活性最高.对该菌的海藻糖合成酶TreS的基因进行克隆,得到一个新的TreS基因PFTreS,该基因与已报道的细菌TreS基因在核酸序列上表现出较高的同源性(最高达80.2%).根据基因序列预测的PFTreS氨基酸序列具有TreS酶的催化功能保守区,与假单胞菌P.fluorescens Pf-5的TreS有很高的同源性.这些结果表明了Pseudomonas extremaustralis中海藻糖的合成特性,为进一步揭示海藻糖的合成与Pseudomonas extremaustralis PF的低温响应机制的关系奠定了基础.     

日本囊对虾电压门控钠通道基因克隆与组织表达

利用基因克隆等分子生物学技术,获得日本囊对虾(Marsupenaeus ja ponicus)的电压门控钠通道(voltage-gate sodium channel,VGSC)蛋白的部分eDNA序列,获得的片段核苷酸长度为2 877 bp,可编码954个氨基酸残基,总分子质量约为108.2 ku.与同源蛋白比较结果显示,日本囊对虾的VGSC序列与其他一些物种具有较高相似性,特别是跨膜蛋白结构域具有极高的保守性.基于VGSC氨基酸序列比对绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测日本囊对虾VGSC的组织表达,结果显示VGSC表达与各组织的功能有极其密切的关系.VGSC mRNA在脑神经节中表达量最高,其次为肝胰腺,说明了钠通道在神经信号传导以及调节内分泌中都起到了重要的作用.     

对细菌中2-氧化戊二酸依赖型加氧酶系存在性的分析

2-酮戊二酸,铁离子和维生素C是氧化戊二酸依赖型加氧酶辅助因子.有的细菌缺少维生素C,因此可能不含维生素C独立体酶,为了确定细菌中是否含有这种酶系,本文首先利用生物学软件ClustalX, PHYLIP, MEME/MAST 和 HMMER在植物和动物体内验证这个酶系的系统发育关系和保守序列,然后利用那些保守序列可以用来检测细菌是否含有这种酶.分析表明细菌中确实含有2-氧化戊二酸依赖型加氧酶酶系.     

SRY基因在部分动物类群系统进化中保守性研究

用特异于人 HMG- box区域的一对引物 ,对脊推动物 5个纲 10个物种及 2种无脊推动物的基因组 DNA进行 PCR扩增 ,并以 dig标记的人 SRY基因为探针 ,与扩增产物进行 Southern杂交 ,结果表明 :在这 12个物种中都存在 SRY基因的同源序列 ,无脊推动物克氏螯虾及背角无齿蚌杂交中显色较慢 ,表明 SRY基因在系统进化中具有高度的保守性且同源程度与物种在进化上的地位有关     

A conserved sequence in the immunoglobulin J kappa-C kappa intron: possible enhancer element

Several functionally important genetic elements (such as the TATA box, mRNA splice sequences, poly(A) addition signal) were first detected as short segments of unexplained sequence homology within non-coding regions of different genes. A short region of unknown sequence in the intron between the human J kappa and C kappa immunoglobulin coding regions was found to be sufficiently homologous to the corresponding segment of the mouse gene to form stable heteroduplexes. Although no specific function has yet been definitely ascribed to this region (which we call the kappa intron conserved region, or KICR), some functional significance has been inferred from the findings that (1) activation of B lymphocytes induces a DNase hypersensitivity site in this region and (2) deletions including this region reduce expression of kappa genes introduced into lymphoid cells. To delineate the KICR more precisely and to test the generality of the sequence conservation in a third species, we have sequenced this region of the human and mouse genes and have examined the corresponding region of a recently cloned rabbit kappa gene. We find a segment of about 130 base pairs (bp) that shows striking conservation in all three species, demonstrating homology significantly higher than within the C kappa coding region itself. Two short sequences from the J kappa-C kappa intron that were noted by other investigators to be homologous to proposed 'enhancer' sequences both lie within the conserved region.