禽流感病毒H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.同时使用该方法对野外样品进行检测.结果表明:该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒.     

禽流感病毒H7亚型快速检测方法建立及应用

通过杂交瘤技术及单克隆抗体技术获得针对禽流感病毒H7亚型的特异性单克隆抗体.抗体用于标记荧光微球,并基于双抗体夹心免疫层析法用于对禽流感病毒H7亚型的检测.针对禽流感病毒H7亚型,检出限为0.125 HAU,具有较高的灵敏度,所建立的禽流感病毒H7亚型荧光检测试纸具有良好的特异性和准确性,可用于对禽流感病毒H7亚型的现场快速检测.     

禽流感病毒型及亚型特异性免疫酶染色技术的研究

 在获得禽流感病毒型及亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立型及亚型特异性免疫酶染色技术,用于检测或鉴定禽流感病毒．优化反应条件,确定单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记二抗的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与病毒分离鉴定比较．结果表明该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床组织样品、鸡胚及细胞培养物中的禽流感病毒．     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

抗甲型流感病毒H1N1亚型单克隆抗体制备及应用

采用快速免疫佐剂免疫小鼠,通过杂交瘤技术获得针对甲型流感病毒H1N1亚型的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株.共获得7株能稳定分泌特异性抗体的细胞株,经腹水诱生和Protein A亲和层析纯化的抗体用于标记荧光量子点,并基于双抗体夹心免疫层析检测用于对甲型流感病毒H1N1亚型的检测.针对甲型流感病毒H1N1亚型,检出限为3.06×10~3TCID_(50)/L,具有较高的灵敏度,所制备的抗体在检测中具有良好的特异性和准确性,可用于对甲型流感病毒H1N1亚型的现场快速检测.     

禽流感病毒三种检测方法的比较研究

对分别应用病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、间接免疫荧光(IFA)3种方法对病料组织中的禽流感病毒(AIV) 进行检测与比较研究。结果显示:经鸡胚尿囊腔接种分离到的病毒,通过用禽流感病毒H5、H9亚型单克隆抗体所进行的血凝(HA)和血凝抑制试验(HI),鉴定为AIV H5亚型毒株;应用RT-PCR技术直接对病料组织抽提的RNA样品进行检测,从病料组织能扩增出大小为229bp的AIV通用目的片段和大小为380bp的H5亚型特异性片段;取病料组织的过滤液接种狗肾上皮细胞(MDCK)单层,24h后用H5亚型AIV特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,结果在细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。研究的结果表明,3种技术都可对病料样品中的AIV进行检测,而RT-PCR和IFA两种方法还可直接对病料样品中的病毒进行亚型的鉴定。相对而言,后两者具有更快速、更敏感、操作更简便的特点。     

禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

对6种禽流感病毒通用型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),PCR检测试剂盒进行比对与科学评价,为实验室采购提供依据。利用禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准品,鸡新城疫活疫苗与传染性支气管炎活疫苗对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对,并对97份临床样品进行了检测,筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。结果表明:A厂家试剂盒最低可检出1:100倍稀释的H7亚型标准品浓度,B厂家试剂盒最低可检出1:1倍稀释的H7亚型标准品浓度,C厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,D厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,E厂家试剂盒最低可检出1:1 000倍稀释的H7亚型标准品浓度, F厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,6种试剂盒特异性均良好。综上,E厂家试剂盒优于其他厂家试剂盒,可以作为动物疫病检测实验室在实施监测任务中的首要选择。     

中国大陆H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传分析及抗原相关性研究

为研究我国大陆H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的分子进化及抗原相关性, 本研究对来自15个省、市、自治区的34株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行了测序及系统发育分析, 并采用交叉血凝抑制试验及交叉攻毒保护试验对不同遗传分支下毒株间抗原相关性进行了分析. 结果表明, 所有34个毒株HA基因均符合低致病性禽流感病毒的特征, 但毒株间变异程度增加. 系统发育分析表明, 我国大陆H9N2亚型禽流感病毒主要分为三个系列, 各系列内毒株没有明显的地区及时间特征. 抗原相关性研究表明, 不同遗传系列下的毒株其抗原相关性明显低于同一系列内部毒株间的抗原相关性, 说明我国H9N2亚型禽流感病毒抗原性差异较大. 此外, 本研究同时筛选得到了用于制备多价苗的代表毒株.     

液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立

目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法。方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析。结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,最佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4 μg/mL。该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85%和2.4%;对58份临床样品检出率为31%。与PCR方法比较,符合率为94.8%。结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点。该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选。     

病毒样颗粒为阳性对照的H5N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性H5N1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将H5N1AIV HA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DNA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有H5N1AIV HA基因RNA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测H5N1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性H5N1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.     

猪流感病毒及其人类公共卫生意义

猪流感是目前危害全世界养猪业的重要呼吸道疾病之一.目前猪流感的致病毒株主要有经典性H1N1,类人型流感病毒,类禽型流感病毒,H1N2亚型流感病毒,H5N1和H9N2亚型流感病毒.特别是从猪体分离H5N1和H9N2亚型流感病毒对禽流感的控制及人类公共卫生方面有重要意义.     

非结构蛋白NS1-ELISA检测禽流感野毒感染抗体

利用RT-PCR技术扩增获得了H5N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为678 bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21(DE3),用终浓度1 mmol／I的IPTG诱导表达5 h,经15％的SDS-PAGE分析表明,诱导表达出了分子量大约为28 KD的 NS1融合蛋白,且以包涵体的形式存在,NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化或用尿素变性复性,获得纯度较高的NS1蛋白,并以此为抗原,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法。最佳包被浓度为2．5μg／ml,血清的最佳稀释倍数为1:200, 酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5 000。重组NS1蛋白只与AIV感染的血清反应,而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗和H9N2纯化病毒免疫的血清,各5份,其平均OD490值分别为0．225、0．210、0．205和0．184．均为阴性;而对H9N2和H5N2亚型活毒感染10-15 d的血清进行检测,各5份,其平均OD490值分别为0．610和0．619,均为阳性。因此,NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,可作为一种鉴别诊断标记,但不能区分亚型．具有A型特异性。NS1-ELISA 方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。     

Subtyping of type A influenza by sequencing the variable regions of HA gene specifically amplified with RT-PCR

The outbreak of a novel influenza A （H1N1） virus across the globe poses a threat to human health. It is of paramount importance to develop a rapid, reliable and inexpensive diagnostic procedure. Based on the bioinformatic information from public database, primers specific for influenza A virus surface protein haemagglutinin （HA） of several subtypes （including H1, H2, H3, H5, H7 and H9） were designed. Primer-specific PCR products were subiected to sequencing for accurately distinguishing H1 and H3 subtypes from others. This sequencing-based detection method will not only be applied to rapid detection and simultaneous subtype identification of new influenza A virus H1N1, but also provide the strategies to monitor other new types of influenza virus with explosive potential.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

 根据已知H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计、合成克隆引物.自灭活的云南地方H5N1亚型病毒阳性临床组织样品中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(Pyobest^TMDNA Polymerase)扩增HA基因,采用Invitrogen定向表达系统(Champion^TMpET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组HA,分子质量约78ku.采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组HA的免疫反应性,结果表明重组HA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性.     

Epidemiological and risk analysis of the H7N9 subtype influenza outbreak in China at its early stage

Dozens of human cases infected with H7N9 subtype avian influenza virus (AIV) have been confirmed in China since March, 2013. Distribution data of sexes, ages, professions and regions of the cases were analyzed in this report. The results showed that the elderly cases, especially the male elderly, were significantly more than expected, which is different from human cases of H5N1 avian influenza and human cases of the pandemic H1N1 influenza. The outbreak was rated as a Grade Ⅲ (severe) outbreak, and it would evolve into a Grade IV (very severe) outbreak soon, using a method reported previously. The H7N9 AIV will probably circulate in humans, birds and pigs for years. Moreover, with the driving force of natural selection, the virus will probably evolve into highly pathogenic AIV in birds, and into a deadly pandemic influenza virus in humans. Therefore, the H7N9 outbreak has been assumed severe, and it is likely to become very or extremely severe in the future, highlighting the emergent need of forceful scientific measures to eliminate any infected animal flocks. We also described two possible mild scenarios of the future evolution of the outbreak.     

长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法的建立与应用

摘要: 目的建立长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法,用于长爪沙鼠体内仙台病毒抗体的检测。方法孵育鸡胚,接种SeV,制备鸡胚尿囊液正常抗原和SeV 特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、精密性、稳定性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0. 1 μg /mL、2 μg /mL 和1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为9. 6% 和8. 4%,批间平均变异系数分别为9. 0% 和5. 9%; 检测灵敏度为1∶ 10 240; 与沙鼠小鼠肝炎病毒( MHV) 、小鼠肺炎( PVM) 、呼肠孤病毒3 型( Reo3) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA 方法特异性、敏感性强,重复性、稳定性好,检测结果,准确、可靠。可用于长爪沙鼠体内SeV 抗体的检测。