转座子Tn5对葡萄根癌病生防菌MI15的诱变

以含自杀性质粒pMO75::Tn5的铜绿假单胞菌PAO1826和含自杀性质粒psup2021:;Tn5的大肠杆菌S17－1为供体菌，以葡萄根癌病生防菌M15为受体菌，进行接合杂交，当供体菌和受体菌菌体数量比例为1：1和1：5时可以产生转移接合子而当菌体数量比例为5：1时不能产生转移接合子，共筛选了117株转移接合子，获得了3株不产细菌的MI15突变株，用光敏生物素标记的Tn5DNA探针与突变株染色体DNA进行斑点杂交，3株突变株均呈阳性反应，证明Tn5转座子已插入到MI15菌株的染色体上引起插入突变并抑制了细菌素的产生。     

具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2菌株的分离鉴定及其att B位点的分析

以稻瘟病菌NO-1为指示菌,从神农架地区土壤中筛选得到一株微生物,命名为ⅠT2.通过形态、生理生化研究和16S r DNA基因序列同源性比对,初步鉴定为链霉菌属.不同发酵条件对链霉菌ⅠT2菌株发酵液抑菌活性的影响研究表明,链霉菌ⅠT2菌株较适合的发酵条件为:发酵温度26.5～30℃,发酵转速150 r/min,发酵时间48 h.利用PCR扩增获得ⅠT2菌株的att B位点序列,链霉菌ⅠT2菌株的att B位点序列长277 bp,与S. griseus M095的att B位点核心区域的序列的相似度为97%,具有发生交换的核心区域5'-TT.含有ΦC31att P位点的整合型质粒p SET152可通过att P位点与链霉菌ⅠT2菌株通过其染色体上的att B位点发生位点特异性重组.     

基因克隆中常用的一些载体及其特征

以大肠杆菌菌株为受体的基因克隆载体通常是由质粒、噬菌体DNA及柯斯质粒DNA纯化和构建的,近年来由这三类DNA构建的大量载体已广泛地应用于基因重组、克隆及表达系统中,在理论研究和生产实践上取得了重大突破和可观的效益,本文就近年来的一些进展做一代表性的介绍。1 噬菌体载体1.1 λgt10由λDNA纯化出来, 这种载体在λ抑制基因(CI)内含有一个EcoRI位点,能接受长     

从猪粪中分离抗铜大肠杆菌及其抗铜基因的初步定位

 从云南昆明周边的4个养猪场采集不同年龄段的猪粪样品,分离猪粪中的大肠杆菌.从分离到的大肠杆菌中发现了具有金属铜抗性的菌株并统计出抗性菌株的发生率.摸索了测定硫酸铜对抗铜性大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)的方法,接合实验确定抗铜基因是否位于可移动的接合质粒上.实验结果初步表明抗铜大肠杆菌的发生率与饲料中添加硫酸铜的量成正相关性,且72%的抗性菌株中的抗铜基因位于可移动的接合质粒上.     

具有抗稻瘟病菌活性的ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立

从湖北省神农架地区土壤中筛选出一株具有抗稻瘟病菌活性的ⅡW1菌株,采用菌块法测定了ⅡW1菌株对稻瘟病菌的抑菌活性,通过形态结构、生理生化和16S rDNA基因序列同源性比对对ⅡW1菌株进行鉴定,同时对链霉菌ⅡW1菌株attB序列进行克隆,并建立接合转移的方法.结果表明:ⅡW1菌株属假灰色链霉菌,链霉菌ⅡW1菌株对稻瘟病NO-1菌株和168菌株的抑菌圈直径分别为29.7 mm和27.4 mm;链霉菌ⅡW1菌株attB序列具有位点特异性重组所必须的核心位点5′-TT-3′.含ΦC31attP位点的整合型质粒pSET152通过两亲接合转移导入链霉菌ⅡW1菌株.     

高产S-腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建

应用PCR技术,以大肠杆菌BL21（DE3）染色体DNA为模板,扩增得到S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶基因。将所得基因连接至表达载体pET-22b（+）,利用T7强启动子进行转录,然后转化进E. coli BL21（DE3）表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶基因的基因工程菌。重组菌所表达的酶活为115U/g（以细胞干重计）。     

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

rhIL-7生物信息学分析及原核系统分泌表达

通过生物信息学分析并预测hIL7糖基化位点、磷酸化位点、信号肽预测、跨膜蛋白、亲疏水性,构建pGEX-4T-1-hIL-7原核表达载体,转化至大肠杆菌LB21(DE3),优化hIL-7表达条件,利用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定重组蛋白.表明hIL-7与猴的同源性一致,是一个含有13个磷酸化位点及3个糖基化位点,具有信号肽的亲水性分泌蛋白.重组载体经DNA测序,显示包含正确的hIL-7编码序列.将pGEX-4T-1-hIL-7重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导表达融合蛋白(含GST标签),相对分子量约为43 000 Da,表达形式为包涵体表达.采用单因素方法对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行考查.在此基础上进行3因素3水平正交实验的统计学优化,得到的最优表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度0.5 mmol/L.     

新疆8个地域维吾尔族群线粒体DNA V区9 bp缺失频率与Y染色体DYS287位点多态性研究

 为研究新疆8个地域维吾尔族群体的线粒体DNA 9 bp序列缺失频率与Y染色体DYS287位点多态性,分别采用PCR扩增直接测序法和PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法对群线粒体DNA 9 bp缺失频率与Y 染色体DYS287位点多态性进行分析。结果表明在新疆的喀什、和田、库车、且木、哈密、吐鲁番、伊梨和尉梨县的240个无关现代维吾尔族群体中,线粒体DNA 9 bp缺失频率为3.3%,3.3%,6.6%,3.3%,6.6%,3.3%,3.3%,10%。在180个无关现代维吾尔族群男性个体中Y染色体DYS287位点全部显示为YAP-,没有显示为YAP＋。结果提示新疆不同地域现代维吾尔族群体的线粒体DNA 9 bp缺失频率相当低,9 bp缺失不是现代维吾尔族的母系遗传传结构特征,而且不同地域维吾尔族群体线粒体DNA 9 bp缺失频率没有显著性的差异。父系遗传结构单一, YAP+不是现代维吾尔族群体的父系遗传特征。研究获得了新疆不同地域维吾尔族群体的线粒体DNA 9 bp序列缺失频率与Y染色体DYS287位点多态性数据,为不同地域维吾尔族群体遗传关系的分析,法医鉴定及不同地域维吾尔族群体之间的起源关系差异提供了一定的遗传背景资料。     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2), Streptomyces maritimus, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454和Streptomyces sp.Tü4128)中分别被克隆.测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性.将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生.将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9.     

贵州9个少数民族线粒体DNA Region V及Y染色体DYS287位点多态性研究

调查贵州9个世居少数民族线粒体DNA Region V以及Y染色体DYS287位点多态性情况,为贵州相关少数民族的遗传背景研究提供可参考的分子遗传学数据。采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶(PCR-SDS PAGE)技术、PCR-琼脂糖凝胶电泳技术检测线粒体RegionV 9 bp序列的缺失、Y染色体DYS287位点多态性。结果显示在本次研究的9个少数民族中线粒体DNA的Region V发现2种多态性,即标准型和缺失性,仡佬族、畲族、壮族、仫佬族、毛南族、蒙古族、回族、羌族、满族线粒体DNA Region V 9 bp缺失频率分别为:26.6%、25%、20%、18.3%、13.3%、10%、8.3%、6.7%、5%;Y染色体DYS287多态显示:仡佬族、仫佬族YAP+携带率分别为20%、1.67%,其余民族全部显示为YAP-。研究获得贵州9个民族人群线粒体DNA Region V及Y染色体DYS287位点多态数据,为各民族群体遗传分析及起源等提供相关遗传背景资料。     

Paenibacillus sp. K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因（nsr）。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。     

SLC1A2基因SNP位点与拉布拉多和金毛猎犬活跃度的相关性研究

目的 检测SLC1A2基因SNP位点与拉布拉多和金毛猎犬活跃度的相关性,以期为导盲犬早期选育筛选有效的遗传学分子标记。方法 选取中国大连导盲犬培训基地的99只犬(拉布拉多犬80只,金毛猎犬19只),采用Passive test(PT)行为测试法对犬的活跃度进行评估。同时采集该99只犬的静脉血,提取血细胞中的基因组DNA样本,采用PCR/测序方法对该99只犬的SLC1A2基因T129C、T1549G 和T471C 3个SNP位点进行基因型鉴定,并统计分析犬的活跃度与SLC1A2 SNP位点的相关性。结果 SLC1A2 基因的3个SNP位点中,T129C和T1549G位点没有多态性,分别仅存在C/C型和G/G型。T471C位点存在3种基因型：T/T、T/C和C/C。这3种基因型与活跃度、性别以及品种间不存在显著相关性(P>0.05)。另外,品种与活跃度之间也没有显著相关性(P>0.05),但性别与活跃度间存在显著相关性(P=0.049)。结论 SLC1A2基因的T129C、T1549G 和T471C位点与导盲犬的活跃度不具有显著相关性,不能作为导盲犬的遗传学筛选的指标。由于性别与活跃度间存在显著相关性,因而在行为学测试中,对犬的活跃度评分标准应雌雄有别。     

大肠杆菌莽草酸生物合成途径的基因操作

为了调查大肠杆菌中相关基因的遗传操作对莽草酸途径和莽草酸积累的影响,利用温度敏感型质粒敲除了大肠杆菌JM83染色体DNA上编码莽草酸激酶的aroL基因,获得了该基因缺陷株JDL02;同时从大肠杆菌JM83染色体中分别克隆了aroG、ppsA和tktA3个基因,构建了多个表达质粒导入JDL02,得到了一系列重组菌。摇瓶发酵显示aroG基因的作用最为明显,各重组菌莽草酸产量均有不同程度的提高;在等生物量情况下,JDL02/pTrc-aroG-tktA的莽草酸产量是JM83的18.35倍,其摇瓶产量为94.33 mg/L。     

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3'端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.     

厦门霉素生物合成基因簇在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中的异源表达

将携带有厦门霉素生物合成的整合质粒p LMO09404,通过供体菌大肠杆菌ET12567(p UZ8002)与受体菌白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008进行接合转移,将得到的接合转移菌株经PCR验证后进行发酵,发酵液经HPLC和质谱检测.结果显示,厦门链霉菌来源厦门霉素基因簇可以在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中异源表达.     

基于线粒体细胞色素b基因序列的蜻亚科部分种类分子系统学研究(蜻蜓目:蜻科)

通过PCR及PCR产物的直接测序技术，测定了蜻蜓目蜻科蜻亚科的灰蜻属、宽腹蜻属和蜻属共7种蜻蜓的线粒体DNA细胞色素b基因的部分核苷酸序列（长度为576bp），探讨了蜻亚科的分子系统学．在所有序列中A＋T平均含量较高，为70．2％，而氨基酸密码子第3位点的A＋T平均含量最高，为85．4％．多态住点数为180个，占总位点数的31．25％，显示出DNA序列变异丰富．基于邻接法、最大简约法和贝叶斯法的分子系统发生，分析结果支持灰蜻属是较进化的类群，宽腹蜻属次之，蜻属是相对分化较早、较古老的类群，这3个属的关系是蜻属→宽腹蜻属→灰蜻属。     

利用酵母同源重组系统克隆肺炎克雷伯菌基因组岛

利用酵母同源重组系统克隆耐药性条件致病菌肺炎克雷伯菌的基因组岛.具体方法为:对20株从临床中分离的肺炎克雷伯菌进行体外tRIP PCR扩增以搜索外源基因纽岛;利用酵母同源重组系统构建作用于arg6 tRNA基因位点的酵母捕捉载体YCV6并克隆该位点的基因组岛.结果表明:在该20株肺炎克雷伯菌中,arg6 tRNA基因位点的tRIP PCR结果都是1.2 kb,没有筛选到大基因组岛插入;所构建的酵母捕捉载体YCV6携带了2个1.8 kb的靶序列,分别与肺炎克雷伯菌arg6 tRNA基因位点两侧的保守序列同源;将线性化的载体YCV6与肺炎克雷伯菌临床株HS04044的总DNA一起转入酵母细胞,利用酵母同源重组克隆临床菌株HS04044染色体上插入arg6位点的小基因组岛.该位点特异性的捕捉载体YCV6可用于克隆肺炎克雷伯菌临床株染色体插入arg6位点的外源DNA序列.     

荚膜红细菌接合转移系统的建立及优化

从培养方式及培养时间对光合细菌Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ的ＤＮＡ接合转移系统进行了优化,研究了该接合转移系统的部分特性,发现接合质粒的大小、受体菌细胞膜的特性对接合效率影响较明显,这为光合细菌基因工程菌的构建提供了基础。