A549-KIF4A过表达细胞株的构建与鉴定

非小细胞肺癌A549细胞中驱动蛋白KIF4A的表达量极低.为研究KIF4A在肺癌发生和发展过程中的作用,利用脂质体转染的方法,将p EGFP-KIF4A质粒和p EGFP-C1质粒分别转入A549细胞中,用G418筛选得到单克隆,并扩增得到稳定表达GFP-KIF4A和GFP的细胞株.利用Western Blot以及免疫荧光染色法对得到的细胞株进行鉴定.结果表明:A549-GFP-KIF4A细胞中GFP-KIF4A蛋白的表达水平较高,A549-GFP-C1中仅表达GFP蛋白.免疫荧光检测表明:A549-GFP-KIF4A过表达细胞中GFP-KIF4A荧光融合蛋白的定位与内源KIF4A的定位相同.     

慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。     

E-cadherin 启动子的荧光示踪体系的建立及验证

为实现对肺癌 A549 细胞的EMT 示踪,构建了 E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒,并与包装质粒pVSVG、Δ8.91 共转染 HEK293T 细胞,包装成有活性的慢病毒,收取病毒感染 A549 细胞,利用流式细胞仪和 Western blot 检测感染成功. 进一步用 TGF-β 诱导感染成功的 A549 细胞,通过在荧光显微镜下观察荧光变化、荧光定量 PCR 和 Western blot 检测GFP 和E-cadherin 的变化,发现在 TGF-β 诱导 48 h 后,A549 细胞形态由鹅卵石样变成长梭形. 并且荧光显微镜观察到相比较于未诱导的细胞,诱导后的A549 细胞绿色荧光明显变暗,同时 GFP 和 E-cadherin 的 RNA 水平和蛋白质表达水平均降低. 以 E-cadherin 基因启动子为基础建立了A549 细胞的EMT 荧光示踪体系,为进一步研究肺癌的 EMT 过程提供了材料.     

柔嫩艾美耳球虫Serpin基因在293T细胞中的表达

为了检测柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,Et)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因(EtSerpin)在真核细胞293T中的表达情况,以Et孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增含完整Serpin开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtSerpin质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtSerpin.该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞,用间接免疫荧光法和Western blot鉴定EtSerpin基因的表达情况,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光,Western blot结果显示出大小约45.5kDa的目的蛋白条带,结果表明构建的EtSerpin可以在293T细胞中获得表达.     

TMEPAI蛋白表达对溶酶体稳定性的影响

本研究旨在构建稳定表达TMEPAI细胞株,研究TMEPAI表达对溶酶体稳定性的影响.采用基因工程技术构建重组表达载体p EF-IRES-TMEPAI-Flag,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达质粒转染A549肺癌细胞,经抗生素puromycin筛选单克隆阳性细胞株,采用免疫印迹实验(Western blot)和免疫荧光技术证实稳定表达TMEPAI细胞株构建成功.通过MTT法、流式细胞技术和吖啶橙染色实验表明,TMEPAI蛋白能够增强溶酶体的稳定性.     

稳定表达TFEB-GFP细胞系的构建及促TFEB入核药物筛选

本研究旨在构建稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞系,并利用其筛选促进转录因子EB(TFEB)入核药物.利用分子生物学技术成功构建了重组表达载体pLVX-AcGFP1-N1-TFEB,并进行慢病毒包装,进而侵染HeLa细胞,通过嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株.采用荧光显微镜技术及免疫印迹技术(Western blot)证实稳定表达TFEB-GFP细胞株构建成功.利用该细胞模型筛选得到促TFEB入核药物盐酸舍曲林(Sertraline HCl),此药物能够促进转录因子TFEB靶基因的表达,并促进细胞自噬.MTT实验表明Sertraline HCl抑制肿瘤细胞活力,其对肿瘤细胞的杀伤作用可能是通过其激活自噬引起的.     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

 hSSB1 (Human Single strand DNA binding protein) 是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank 提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中, 连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株, 为深入研究其功能奠定了基础。     

基于数据库分析FOXG1在非小细胞肺癌中的表达和临床意义及稳定过表达FOXG1肺癌细胞株A549的构建

通过TCGA数据库分析FOXG1在非小细胞肺癌中的表达及预后相关性，建立稳定过表达人源FOXG1基因的肺癌细胞株A549。利用TCGA数据库中下载基因表达数据和临床信息，分析FOXG1在非小细胞肺癌和正常组织的表达差异、FOXG1表达水平与临床病理特征及生存预后的相关性并进行基因集富集分析。通过HEK-293T包装慢病毒表达载体，收集病毒上清液侵染A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定过表达FOXG1的A549细胞株。细胞核染色鉴定外源FOXG1表达定位，Western blot检测外源FOXG1的表达情况。结果发现FOXG1在非小细胞肺癌组织中高表达，且FOXG1高表达能够降低患者总体生存率。FOXG1的表达水平与患者年龄相关，与性别，分级以及TMN分期无关；细胞周期、P53、Notch等信号通路在高表达FOXG1的非小细胞肺癌组织中被激活；慢病毒表达载体共转染HEK-293T细胞成功；病毒上清液侵染A549细胞，24 h后可见绿色荧光表达，72 h后对照组空载体病毒颗粒侵染效率高达80%左右，实验组过表达FOXG1病毒颗粒侵染效率为50%~60%；经嘌呤霉素筛选培养后，对照组和实验组荧光效率均达到90%以上；细胞核染色外源FOXG1基因定位在细胞核中，Western blot结果显示外源FOXG1在细胞中正确表达。因此可以认为FOXG1基因在非小细胞肺癌患者中高表达，其表达水平与患者总体预后有关且稳定表达FOXG1的A549肺癌细胞株构建成功。     

RBM5蛋白的RNA识别区在肿瘤细胞周期调控中作用的研究

为分析RNA识别区(RNA recognition motif,RRM)在RBM5蛋白调控肿瘤细胞周期中的作用,本研究利用低表达RBM5的A549细胞系构建了A549/Vector、A549/RBM5-WT、A549/RBM5-△RRM三种稳定细胞株,通过流式细胞术检测,发现仅有A549/RBM5-WT能显著阻滞细胞于G1期,说明RRM区是RBM5抑制细胞周期进程必不可少的区域.利用Western Blot检测细胞中cyclin A与Phospho-Rb(ser 795)的蛋白水平差异,证明了RBM5蛋白的RRM能够参与其介导的pRb去磷酸化以及抑制cyclin A表达,从而抑制细胞周期进程.     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究

目的探讨抑癌基因IL-24联合大蒜素对肺癌A549细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法提取前期构建的p DC316-h IL-24-EGFP质粒,转染肺癌A549细胞,分为A组(空白对照组)、B组(单独大蒜素组(40μL/m L))、C组(脂质体+IL-24组)、D组(大蒜素(40μL/m L)+脂质体+IL-24).荧光显微镜下观察质粒的转染情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot法检测p DC316-h IL-24-EGFP、大蒜素和联合用药作用A5 4 9细胞4 8 h后IL-24,Bax,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平.结果大蒜素(40μL/m L)和p DC316-h IL-24-EGFP单用48 h对A549细胞均有明显抑制作用;大蒜素(40μL/m L)联合p DC3 1 6-h IL-24-EGFP比单用p DC3 1 6-h IL-24-EGFP作用更强(P0.05);大蒜素(40μL/m L)、p DC316-h IL-24-EGFP和两药联用48 h后,A549细胞凋亡率分别为32.7%,39.4%和68.8%;大蒜素(40μL/m L)和/或IL-24作用于A549细胞48 h后,Bax/Bcl-2的比值及Caspase-3表达均上调,联合用药组效果尤其明显.结论p DC316-h IL-24-EGFP联合大蒜素可协同抑制人肺癌A549细胞生长,机制可能是通过调节基因Bax/Bcl-2的表达比率,并上调Caspase-3的表达,进而诱导A549细胞的凋亡.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

BMP7基因真核表达载体的构建及荷瘤小鼠制备

目的克隆BMP7基因及构建BMP7基因真核表达载体,稳定转染于H22细胞系,制备荷瘤小鼠。方法应用RT-PCR技术从人胚肾细胞系293T细胞总RNA中成功扩增出1 293 bp包含BMP7基因编码区的cDNA序列,在上下游加上BamHI及HindⅢ双酶切位点后形成带酶切位点的BMP7基因,然后连入含BaraH I及HindⅢ双酶切位点的pEGFP-C1表达质粒上,构建BMP7基因的重组真核表达质粒pEGFP-C1-BMP7。脂质体介导方法转染细胞,RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达,皮下注射制备荷瘤小鼠。结果扩增的cDNA经测序比较与基因文库完全一致;BamHI及HindⅢ双酶切后,质粒形成约4.7 kb和约1.3 kb两条带,与理论计算值完全一致。注射转染BMP7基因后H22细胞小鼠瘤体明显增大。结论成功克隆BMP7基因及构建BMP7基因的真核表达载体。BMP7基因高表达可能是细胞癌变的原因之一。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。