异源四倍体鲫鲤成熟性腺和红细胞超微结构观察

用透射电子显微镜观察了繁殖季节异源四倍体鲫鲤成熟精巢、卵巢和血液中红细胞超微结构.成熟精巢由许多小叶组成,小叶内可观察到精原细胞、精子细胞和大量成熟二倍体精子.精原细胞的细胞质内可见核糖体、内质网、线粒体和电子致密物质;支持细胞的细胞质中可见内质网和明显的可能与激素合作有关的颗粒状物质.二倍体精子由头部和尾部组成,头部内充满致密染色质,尾部中央轴丝具有典型"9+2"微管结构.成熟卵巢中Ⅳ和Ⅴ时相卵母细胞外包围着两层滤胞细胞;内层滤胞细胞伸出微绒毛深入透明带和卵黄膜内,并一直延伸到卵细胞的细胞质内.推断微绒毛具有物质和信息交流的功能.Ⅳ时相和Ⅴ时相卵母细胞内的卵黄具有两种形式,一种其外有囊泡包围,另一种外面没有.红细胞中32.43%的细胞核具有独特的哑铃状结构,超微结构显示这种哑铃状结构为细胞核的弯曲变形现象;少数红细胞核有一分为二的分裂现象.红细胞核的这些特征可作为区别四倍体鱼和二倍体鱼的重要标志.在亚显微水平证明四倍体鲫鲤具有正常的成熟精巢和卵巢,它们能够产生正常的二倍体精子和卵子,保证四倍体性能代代相传.     

洞庭青鲫和洞庭青鲫(?)×兴国红鲤(?)杂交F1代的RAPD分析

以鱼的尾鳍为材料,采用苯酚-氯仿法提取鱼的基因组DNA.对提取的结果进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳方法的鉴定,筛选出浓度、纯度好的DNA样品进行进一步的RAPD扩增.采用上海生化工程有限公司的80个引物对洞庭青鲫和洞庭青鲫(?)×兴国红鲤(?)杂交F1代(简称"杂交鱼")进行RAPD分析,筛选出9个引物对洞庭青鲫和杂交鱼进行了遗传多样性分析,这9个引物共检出洞庭青鲫89个位点、杂交鱼82个位点.其中多态性位点数:洞庭青鲫76个,杂交鱼71个分别占其总位点数的85.39%、86.58%.据RAPD data analyzer 1.3v.exe ＜RAPD data analyzer v1.3.xls>数据分析程序计算,洞庭青鲫平均遗传相似度为0.653 7;杂交鱼的平均遗传相似度为0.621 8;两种群间的为0.550 5.上述两项指标的初步分析表明,这两种鱼具有较为丰富的遗传多样性.     

洞庭青鲫和洞庭青鲫(♀)×兴国红鲤()杂交F_1代的RAPD分析

以鱼的尾鳍为材料,采用苯酚—氯仿法提取鱼的基因组DNA.对提取的结果进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳方法的鉴定,筛选出浓度、纯度好的DNA样品进行进一步的RAPD扩增.采用上海生化工程有限公司的80个引物对洞庭青鲫和洞庭青鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交F1代(简称“杂交鱼”)进行RAPD分析,筛选出9个引物对洞庭青鲫和杂交鱼进行了遗传多样性分析,这9个引物共检出洞庭青鲫89个位点、杂交鱼82个位点.其中多态性位点数:洞庭青鲫76个,杂交鱼71个分别占其总位点数的85.39%、86.58%.据RAPDdataanalyzer1.3v.exe数据分析程序计算,洞庭青鲫平均遗传相似度为0.6537;杂交鱼的平均遗传相似度为0.6218;两种群间的为0.5505.上述两项指标的初步分析表明,这两种鱼具有较为丰富的遗传多样性.     

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼，该三倍体鲫鱼的体侧扁，近似纺锤形，体色为青灰色，无口须.它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间，并且一些可量比例性状超出亲本范围，体现出杂种特征.第一年养殖结果表明，把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养，三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11.11%.性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后，生殖细胞呈退化现象.与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比，三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点，而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征，这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义.     

鱼类转基因早期胚胎细胞的核移植研究

像许多转基因高等生物一样,用显微注射方法研制的转基因鱼均为转植基因嵌合体,培育纯合转基因品系已成为研究者们向往和追求的目标.以澎泽鲫(Carassius auratus,Pengze var.)和黄河鲤(Cyprinus carpio,Huanghe var.)为实验材料,以转基因囊胚细胞核或原肠胚细胞核为供体,进行了细胞核移植.检测了转植基因在所获得的移核胚胎和5尾澎泽鲫移核鱼及1尾黄河鲤移核鱼中的存在状况,分析了用转基因早期胚胎细胞核移植方法研制纯合转基因鱼的可能性.     

成对鲫游泳行为与标准代谢率的关系

【目的】考察成对鲫(Carassius auratus)幼鱼的游泳行为与标准代谢率(Standard metabolic rate,SMR)的关系。【方法】在(25±0.5)℃条件下测定60尾鲫幼鱼的SMR并筛选出20尾高SMR个体和20尾低SMR个体,再将1尾高SMR和1尾低SMR个体进行随机组对,在行为观察装置中分别测定单尾鱼(两水箱中间有隔板)和成对鱼(两水箱中间无隔板,可见对方)在危险区域和安全区域的运动时间及频率、进入食物环1倍体长范围频率以及高SMR个体与低SMR个体相互追随的时间。测定工作进行两次,分别称为测定Ⅰ和测定Ⅱ。【结果】1)成对实验鱼之间的好斗频率与SMR个体差异不相关,不论是低SMR个体追随高SMR个体,还是高SMR个体追随低SMR个体,追随时间也均与SMR个体差异不相关。2)在实验水箱中间有隔板条件下,实验鱼不仅在安全区域的停留时间比明显高于在危险区域的停留时间比,而且静止时间比明显大于运动时间比,但取走隔板后实验鱼在两区域的停留时间比无明显差异,并且运动时间比大于静止时间比。3)不论中间有无隔板,单尾鱼于测定Ⅰ时在危险区域停留时间比、安全区域停留时间比、运动时间比及进入1倍体长范围食物环频率均与在测定Ⅱ时获得的对应指标呈正相关关系;除进入1倍体长范围食物环频率外,单尾鱼在中间有隔板的游泳行为特征数据与中间无隔板的游泳行为特征数据均呈正相关关系。【结论】SMR可能不是成对鲫幼鱼游泳行为中领导者的重要特质,但两者的视觉信息交流可改变两者的游泳行为特征,并且鲫幼鱼在不同实验条件下的游泳行为特征保持较高的重复性。
     

异源四倍体鲫鲤群体的形成及四倍体化在脊椎动物进化中的作用

对雌雄两性能育并形成群体的异源四倍体鲫鲤的染色体数目和组型,DNA含量,红细胞大小,生殖腺和配子,胚胎发育,形成机理,外形等方面进行了较全面描述。四倍体鲫鲤经过九代（F3-F11）的四倍体性的繁殖,已形成了一个数目庞大的遗传性状稳定的群体。该四倍体群体在染色体数目、生殖、外形特征等方面都与它们的原始父母本-二倍体湘江野鲤和红鲫有本质的差别。在遗传特性、稳定传代、生育隔离等方面,异源四倍体鲫鲤群体为形成一个新的四倍体新种奠定了基础。新的四倍体鱼群体的形成对脊椎动物的进化理论和它们在生产上的应用都具有重要的意义。     

用团头鲂精子诱导红鲫雌核发育的研究

用遗传失活的团头鲂（Megalobrama amblycephala）的精子诱导红鲫（Carassius auratus Red Variety）进行雌核发育的研究. 红鲫的卵子经适宜UV剂量灭活处理的团头鲂精子激活后，在0—4℃下冷休克40min抑制第二极体的排出使染色体加倍，获得雌核发育红鲫. 它们的受精率、孵化率及成活率分别为（52.6±3.0）%，（23.6±4.1）%和（15.7±3.4）%，其成活率明显高于用鲤鱼精子诱导红鲫雌核发育的成活率（11.3±2.2）%. 以外形特征、染色体数目及性腺发育程度为依据对雌核发育红鲫与对照杂交鱼进行了区分和鉴定，结果表明，Ⅰ龄鱼的体色为红色，染色体数目为100，性腺发育正常的个体为成功的雌核发育红鲫；而染色体数目为124或148，性腺发育滞后的个体为杂交鱼，其中三倍体鲫鲂是不育的（2年观察证明），而四倍体鲫鲂2年才能达到性成熟. 以鲤鱼的精子作为对照，着重讨论了团头鲂精子作为刺激源的优势，即能提高雌核发育鱼的成活率，并可简化对雌核发育鱼的鉴定，研究证明团头鲂的精子是一种非常有效的诱导鲫鱼进行雌核发育的刺激源.     

成对鲫游泳行为与标准代谢率的关系

【目的】考察成对鲫(Carassius auratus)幼鱼的游泳行为与标准代谢率(Standard metabolic rate,SMR)的关系。【方法】在(25±0.5)℃条件下测定60尾鲫幼鱼的SMR并筛选出20尾高SMR个体和20尾低SMR个体,再将1尾高SMR和1尾低SMR个体进行随机组对,在行为观察装置中分别测定单尾鱼(两水箱中间有隔板)和成对鱼(两水箱中间无隔板,可见对方)在危险区域和安全区域的运动时间及频率、进入食物环1倍体长范围频率以及高SMR个体与低SMR个体相互追随的时间。测定工作进行两次,分别称为测定Ⅰ和测定Ⅱ。【结果】1)成对实验鱼之间的好斗频率与SMR个体差异不相关,不论是低SMR个体追随高SMR个体,还是高SMR个体追随低SMR个体,追随时间也均与SMR个体差异不相关。2)在实验水箱中间有隔板条件下,实验鱼不仅在安全区域的停留时间比明显高于在危险区域的停留时间比,而且静止时间比明显大于运动时间比,但取走隔板后实验鱼在两区域的停留时间比无明显差异,并且运动时间比大于静止时间比。3)不论中间有无隔板,单尾鱼于测定Ⅰ时在危险区域停留时间比、安全区域停留时间比、运动时间比及进入1倍体长范围食物环频率均与在测定Ⅱ时获得的对应指标呈正相关关系;除进入1倍体长范围食物环频率外,单尾鱼在中间有隔板的游泳行为特征数据与中间无隔板的游泳行为特征数据均呈正相关关系。【结论】SMR可能不是成对鲫幼鱼游泳行为中领导者的重要特质,但两者的视觉信息交流可改变两者的游泳行为特征,并且鲫幼鱼在不同实验条件下的游泳行为特征保持较高的重复性。     

异育淇鲫及其双亲的过氧化物酶和α-淀粉酶同工酶的比较研究

采用聚丙烯酰胺垂直平板电泳,对异育淇鲫及其母本淇鲫和父本兴国红鲤的6种组织(心脏、肝脏、肾脏、脑、晶状体和骨骼肌)中的过氧化物酶和α淀粉酶同工酶进行比较研究.结果显示:异育淇鲫同工酶的电泳图谱与母本淇鲫相同,与父本兴国红鲤显著不同.因而认为异育淇鲫是雌核发育的产物,父本遗传物质对子代无影响.     

不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

七彩神仙鱼胚胎及仔鱼发育研究

对七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciata)胚胎及仔鱼发育进行了研究,详细描述了发育各期的形态特征和所需时间.结果显示,七彩神仙鱼受精卵为红褐色粘性卵,在(29.0±0.5)℃时,孵化所需时间为52.5h.初孵仔鱼体长(3.52±0.19)mm,体高(1.27±0.07)mm,身体透明,头部粘附在产卵基上,尾部随着水流颤动.仔鱼出膜5d后亲鱼开始"奶子",到第13d基本发育完善.     

鲤、鲫鱼对交流电刺激的反应特性

本文研究了鲤、鲫两种淡水底层鱼对交流电刺激的感电、麻醉、击昏反应及断电后的苏醒过程。结果表明:鲤、鲫鱼电击前感电阈值分别为1.66 V/m、2.63 V/m,电击后感电阈值明显提高,分别达到2.49 V/m、3.56 V/m。鲫鱼电击前浙增组感电阈值极显著地大于浙减组,但电击后这种差异消失。鲤、鲫鱼击昏阈值均极显著地大于麻醉阈值,前者分别为25.18 V/m、29.01 V/m,后者分别为16.27 V/m、19.04 V/m,两种情况下鱼所表现的行为特征也完全不同.鱼对交流电的反应可分成四个阶段:感电、定向、麻醉和击昏反应。受电击昏的鲤、鲫鱼在断电后的苏醒过程有所不同,但均具有阶段性。     

妊娠糖尿病母鼠其胎儿心脏P38 MAPK的表达及意义

目的:了解p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)在妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)母鼠胎儿心脏中的表达规律,旨在探讨其与妊娠期糖尿病母鼠其婴儿发育异常的内在联系.方法:取成年雌性SD大鼠随机分成两组,通过阴道涂片确定怀孕后分别注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)及柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,建立GDM组和对照组,给药后72 h隔天测血糖及体质量.两组大鼠分别于孕后第12、15、19 d随机抽取剖宫,进行胎鼠心脏取材,HE染色观察心脏组织病理变化,免疫组化检测P38 MAPK的蛋白表达量,荧光定量PCR方法检测心脏组织P38 MAPK mRNA的表达.结果:①对照组子鼠心脏发育情况正常,未见心肌壁异常增厚、房室间隔病理性缺损及动脉圆锥干畸形等异常情况.高倍镜下可见心肌细胞呈椭圆形,胞浆丰富,核大,形态规则,染色均匀.GDM组12、15、19 d均可见子鼠心脏发育异常,包括室间隔缺损、圆锥干发育畸形、心肌异常肥厚及心腔扩大等,高倍镜下可见12、15 d心肌细胞结构较清晰,细胞肿胀,胞浆溶解,胞核形态尚规则,细胞结构不清.19 d细胞可见胞浆溶解,成片的无结构区,胞核形态不规则.②第12、15、19 d GDM组p38MAPK蛋白在胎鼠心肌细胞胞浆中的表达显著增强,与相应时间点的对照组相比均明显增高,在GDM组中,以第12 d的表达最强.③第12、15、19 d GDM组胎鼠心脏组织中p38 MAPK mRNA的相对表达量明显高于相应时间点的对照组.结论:妊娠糖尿病母鼠其胎鼠心脏发育异常的发生率明显升高.p38 MAPK蛋白及mRNA在妊娠糖尿病胎鼠孕12、15、19 d三个观察点的心脏表达水平明显增高,提示其可能参与妊娠糖尿病致心脏发育异常的过程.     

不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标(红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容)、细胞大小(红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值)及它们的显微结构进行了比较研究,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构.结果表明:在不同倍性鱼中,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高;血红蛋白无显著差异;在细胞大小上,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系;在红细胞的形态方面,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异.同时发现随着倍性的升高红细胞的短径/长径比值减小.在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ,Ⅲ两种类型,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞.对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析.     

细锯脂鲤银膜及全透两个品系的体色及发育的对比

细锯脂鲤(Pristella maxillaris)因其成鱼体色透明而越来越受到模式生物研究学者们的青睐.本研究从组织形态学和细胞学水平连续观察了银膜和全透两个品系细锯脂鲤不同发育时期眼睛、鳃部、腹部、背鳍、臀鳍及尾鳍的特征.结果表明:(1)银膜系鱼中观察到3种色素细胞,发育时序为黑色素细胞、虹彩细胞和黄色素细胞;全透系鱼中仅先后出现黑色素细胞与黄色素细胞2种色素细胞.(2)背鳍中部,银膜系鱼仅有树突状黑色素细胞,全透系鱼还具有颗粒状黄色素细胞;臀鳍中部,银膜系鱼的黑色素细胞均为树突状,但全透系鱼中黑色素细胞与黄色素细胞形态都为颗粒状;尾鳍中部,银膜系鱼均匀分布着散射状黄色素细胞,而全透系鱼黄色素细胞形态除散射状外还呈颗粒状形态.(3)银膜系鱼眼睛、背鳍与臀鳍上的黑色素细胞数量均多于全透系鱼,而黄色素细胞数量则相反.上述研究结果可为后续相关鱼类体色发育机制及可视化模式生物的建立提供重要的基础资料.     

对拟细鲫( Nicholsicypris normalis) 与瑶山鲤 ( Yaoshanicus arcus) 的比较和澄清

在形态和解剖上对拟细鲫和瑶山鲤做了比较，得出这两个种是真实有效但需重新界定．认为身体细长、胸腹面平宣、瞳孔通常较大、侧线以上鳞片有显著月牙形黑斑、肠管较细、肠壁较厚、肠盘曲紧密、下咽骨较细小为拟细鲫；身体为长形、体很侧扁、胸腹部很突出、瞳孔较小、身体侧面鳞片无显著黑斑、肠管较粗、肠壁薄、肠盘曲松弛、下咽骨粗壮的为瑶山鲤．从而对多年来在这两者分类上出现的混乱情况给予了澄清．     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析

参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用.     

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

复合四倍体彭泽鲫胚胎发育的研究

分别用复合四倍体彭泽鲫的母本种彭泽鲫和父本种尖鳍鲤的精子与复合四倍体彭泽鲫的卵子授精,在Nikon体视显微镜下对它们的胚胎发育过程进行连续观察.描述了23个发育时期的主要形态特征,观察了不同水温条件对胚胎发育速率的影响,比较了复合四倍体彭泽鲫与异育彭泽鲫胚胎发育过程的异同.发现二者在受精卵的大小、受精后皮质颗粒、肌节对数、眼晶体形成时间、积温等方面都存在差异,复合四倍体彭泽鲫比异育彭泽鲫的胚胎发育历时要少.在上述研究的基础上,发现来自母本种和父本种的两种不同精子与复合四倍体彭泽鲫的卵子授精,得到的胚胎在发育过程中未表现出明显差异,暗示复合四倍体彭泽鲫的卵子在应答母本种和父本种精子时表现出相同的生殖方式,即雌核发育生殖方式.本研究的结果和结论与在人工复合四倍体异育银鲫中观察到的现象存在显著差异.