结核分枝杆菌特异性抗原的N末端氨基酸序列分析

把ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析抗原抗体反应的高度特异性与ＰＶＤＦ膜作为载体进行蛋白质氨基酸序列分析的高度敏感性相结合对结核分枝菌的特异性抗原表位刊物筛选和分析鉴定,获得了一个分子质量为３１ｋｕ,Ｎ末端为ＡｌａＧｌｕＶａｌＡｓｐＬｅｕＶａｌＰｈｅＡｌａＶａｌＳｅｒＴｒｐＰｒｏＶａｌＧｌｙ的结核分枝杆菌抗原。     

结核分支杆菌H37Rv株抗原成份分析

通过免疫印迹技术（Western blotting），用结核杆菌的单克隆抗体及兔抗结核菌多克隆抗体对结核分支杆菌H37Rv的菌体蛋白和培养液蛋白成份进行了初步分析，发现固体培养菌与液体培养菌的菌体具有基本一致的多肽抗原成份，而培养液中的抗原成份与前两者差异稍大。通过筛选和鏊定结核分枝杆菌的特异性和保护性抗原，研究结核杆菌的免疫反应特点，为探索结核病的诊断和治疗的新途径奠定了一定的基础。     

结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,转化入E.Coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot,以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.PCR扩增获得的目的基因为432bp,与预期大小一致,测序与Genebank公布的基因序列完全一致.成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,转化E.Coli DH5α后能特异性表达目的蛋白,大小约16KD,与理论值相一致.蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在,纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带.成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,并获得纯化的目的蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础.     

表达结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白

利用大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,构建能够表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, M.s）。采用聚合酶链反应（PCR）方法,从MTB H37Rv基因组DNA中扩增MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段并克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后分别亚克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22,将重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿孔导入M.s,42℃热诱导表达目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot分析。利用PCR方法扩增获得MTB休眠相关抗原Rv2031c和Rv2626c基因片段,大小分别为435bp和480bp,基因测序与Genebank公布的基因序列完全一致。SDS-PAGE分析结果表明重组载体pDE22-Rv2031c-Rv2626c电穿导入M.s后能够特异性表达目的蛋白,大小约为35kDa,与理论值相符。Western-blot鉴定结果表明抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体均能够与目的蛋白发生特异性的反应,大小相一致。成功构建表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,并命名为Rv2031c-Rv2626c-rM.s,为其用于结核新型疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌的免疫机制及抗原研究进展

结核分枝杆菌是一种胞内病原苗，在抗结核分枝杆菌感染中，活菌疫苗中的分泌蛋白起主要的免疫保护作用，它们激活宿主Ｔ细胞介导的细胞免疫，影响宿主免疫保护与病菌耐受性之间的不稳定平衡，决定宿主是否得病．结核分枝杆菌的特异性和保护性抗原的筛选为结核病的快速诊断及新型疫苗构建打下基础．     

结核分枝杆菌单克隆抗体与自身抗原组蛋自的免疫交叉反应研究

WesternBlot实验证实了结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）H37Ra的单克隆抗体与自身抗原组蛋白发生免疫交叉反应．利用计算机软件对交叉反应的分子生物学基础进行了分析,发现结核分枝杆菌H37Ra的蛋白与组蛋白H1,H2A,H2B,H3,H4各有一个包含3个或4个氨基酸的序列同源区域．     

结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性的检测及耐药基因突变位点分析

为检测结核分枝杆菌链霉素(streptomycin,SM)耐药性,分析耐药基因突变,探讨DNA测序分析技术在结核分枝杆菌链霉素耐药性检测中的应用价值。采用方法:1、用传统的比例法药敏试验对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测。2、用DNA测序分析技术对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药相关基因Rpsl和rrs的突变位点分析,筛查耐药相关突变位点。3、探讨DNA测序分析技术对结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测的效率。结果:1、传统比例法药敏试验结果显示,49株实验菌株中16株为链霉素耐药株,33株为链霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA测序。结果显示:Rpsl基因只存在一个突变位点,为第43位密码子AAG的突变,突变形式为AAG→AGG,氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。rrs基因DNA测序结果发现:rrs基因共存在5个突变位点,分别为第513位碱基A突变为G、第523位碱基A缺失、第598位碱基A突变为G、第599位碱基A缺失、第612位碱基A缺失,其中第513位碱基突变只存在于链霉素耐药株中,其余4个突变位点在耐药株和敏感株中均存在。即初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。3、分析Rpsl基因和rrs基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性之间的关系,结果显示:16株链霉素耐药株中13株存在Rpsl基因第43位密码子的突变,1株存在rrs基因第513位碱基的突变。以传统的比例法药敏结果为参照,以DNA测序分析Rpsl基因或rrs基因发现Ppsl基因发生第43位密码子或rrs基因第513位碱基突变为判断菌株耐药的标准,DNA测序分析技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性检测的敏感性为87.5%,特异性为96.97%。由此可知,初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。用DNA测序分析结核分枝杆菌Rpsl基因和rrs基因链霉素耐药相关突变,判断结核杆菌链霉素耐药性具有较好的灵敏度和特异性,耗时短,在链霉素耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

痢疾杆菌膜表面抗原分析

采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＃胶电泳和免疫印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）对痢疾杆菌膜表面抗原进行了分析，测定了主要蛋白的分子量。依电泳凝胶染色和免疫印迹图谱，分析了痢疾菌４个群的主要抗原及福氏菌的群特异性抗原和两个型的型特异性抗原，并比较了志贺氏菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）实验选用菌株的抗原蛋白。同时，对几种菌的生长曲线进行了测定。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

七叶苷与牛血清白蛋白相互作用的分子对接研究

采用分子对接方法研究了药物小分子七叶苷与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用,获得了七叶苷与BSA的结合模式信息.分子对接结果表明,七叶苷分子与蛋白活性空腔内的氨基酸残基形成疏水作用和氢键作用.这些基团之间的相互作用是七叶苷与BSA稳定结合的关键因素.研究结果可为相关实验研究提供微观结构信息.     

一株南海珊瑚细菌L-4抗肿瘤活性次生

 在研究珊瑚微生物混合共培养时发现：在混合培养中南海珊瑚内生细菌L-4对真菌的次生代谢产物明显产生影响,甚至产生此二微生物单独培养时所不产生的物质。对L-4发酵液进行次生代谢产物研究,从中分离纯化得到8个单体化合物,通过现代波谱分析（MS、NMR等）和物理常数对照等手段确定其结构依次为：环（色-丙）二肽（1）、环（甘-酪）二肽（2）、环（丙-酪）二肽（3）、环（缬-酪）二肽（4）、环（甘-苯丙）二肽（5）、环（甘-脯）二肽（6）、环（丙-缬）二肽（7）、环（甘-丙）二肽（8）均为环二肽类物质,且均首次从南海珊瑚内生细菌中分离得到,对进一步研究其可能的代谢机制具有重要意义。     

珍珠薏米乳酸发酵饮料的研究

研究了以珍珠和薏米为主要原料制作乳酸发酵饮料的工艺。通过正交试验,确定最佳调配组合为:蔗糖10%,香精0.1%,薏米发酵液与珍珠水解液的体积比为2∶1。对饮料的可溶性固形物、酸度、还原糖、金属元素、氨基酸含量等指标进行了测定。结果表明,还原糖质量浓度为11.9 mg.mL-1;可溶性固形物为4.6%;pH值为4.97(16.5℃时);Zn、Mg、Fe、Mn、Na、Ca、K的质量浓度分别为0.1672,5.14340,.23260,.2933,241.76,136.093,4.87μg.mL-1;Cd、Pb、Cr、Cu和Co等均未测出;且含有Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、MetI、le、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro等16种氨基酸。     

不同染色体倍性滇韭和多星韭的抗逆性初探

以不同染色体倍性的滇韭和多星韭为材料,对其抗逆性进行了比较.结果表明:滇韭和多星韭的二倍体SOD酶与POD酶活性均比四倍体的高,MDA的含量比四倍体的低,而四倍体叶中脯氨酸的含量比二倍体的高.就叶中总氨基酸的组成而言,二倍体和四倍体均以天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸为主要组分,但各氨基酸的含量也有一定的差异.这表明不同染色体倍性的滇韭和多星韭可能存在不同的抗逆性机制.     

二蕊荷莲豆中的一个新环肽

从石竹科植物二蕊荷莲豆 (DrymariadiandraBl.)中分离得到一个新的环九肽 ,其结构经波谱鉴定为环 ( -脯 -脯 -苯丙 -苯丙 -缬 -异亮 -丙 -苯丙 -亮 - ) .     

真菌Penicillium sp. MO3 产生的抗菌肽AF2的分离纯化和性质的研究

从真菌Penicillium sp. M03发酵液中提取到一种具有抗菌活性的肽类物质AF2，并对其性质进行初步研究. 真菌发酵液经纱布过滤，离心后经10000D超滤膜超滤，冻干，以纯水溶解经Sephadex LH-20，DEAE Sepharose及Sephadex G-15进行分离纯化得到纯净物质，并对其基本性质进行研究. 结果证明：AF2具有典型的肽类物质特征反应，分子量约为1155，含有12种常见氨基酸，对酸碱，胰蛋白酶，β-内酰胺酶稳定，对热有较好的耐受性.     

大亚湾沉积物中氨基酸的垂直分布——沉积物柱样W9中的水解氨基酸和游离氨基酸

目的：研究沉积物中水解和游离氨基酸的垂直分布特征。方法：采集60 cm大亚湾柱状沉积物样品，每2cm为一层分割，用反相高效液相色谱法分析每层样品中的水解和游离氨基酸含量，对分析结果进行曲线拟合的相关分析。结果：15种游离氨基酸和水解氨基酸中的丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸含量的对数值与深度之间存在显著的线性关系；中性氨基酸甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的水解和游离氨基酸含量之间存在显著的相关关系。结论：15种游游离氨基酸和6种中性水解氨基酸的垂直分布可用指数方程来描述；中性水解氨基酸和游离基酸之间存在显著的相关性。     

珍珠角壳蛋白中氨基酸的高效液相色谱分析

采用国产C18反相柱,对以异硫氰酸苯酯（PITC）为柱前衍生化试剂的高效液相色谱测定氨基酸的方法进行了研究,在室温下,以pH=6.3的HAc-NaAc缓冲溶液及乙腈水溶液为流动相进行梯度洗脱,18种常见氨基酸在30min内获得了较好的分离,并且测定了珍珠角壳蛋白的氨基酸组成,结果表明：珍珠角壳蛋白主要由天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸等10种氨基酸组成,这些氨基酸约占蛋白总量的85％。     

含酸性基团温度敏感色谱材料的制备及其在氨基酸分离中的应用

用自由基聚合法制备了分别含有聚(N-异丙基丙烯酰胺/2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸)和聚(异丙基丙烯酰胺/甲基丙烯酸异丁酯/丙烯酸)的2种酸性温敏色谱填料.用热失重和元素分析表征了接枝率.用HPLC研究了异硫氰酸苯酯衍生化丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、亮氨酸等6种氨基酸的色谱保留行为.结果显示,采用纯水相为流动相,仅通过控制柱温即可实现分离,证明被分离物的色谱保留性质随温度的改变而变化,制得的色谱填料具有温度敏感性.