多重PCR检测病死鸡中沙门氏菌方法的研究

为了建立能够同时检测病死鸡样品中的沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的多重PCR 方法.采用煮沸法提取 DNA 做为模板,选择分别针对沙门氏菌属、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的特异性基因(invA、fliC、sdfⅠ)设计引物,优化反应体系和反应参数,建立多重PCR检测方法.应用该方法对国内17家鸡场369份病死鸡样品进行沙门氏菌的检测,检测结果与传统细菌培养法的结果进行比较.结果表明,优化过的多重 PCR 可同时对沙门氏菌种、属进行鉴定,灵敏度为4.6×102 CFU/mL;多重 PCR 方法共检测出沙门氏菌34株,其中鸡白痢沙门氏菌21株、肠炎沙门氏菌5株,与传统细菌培养法检测结果的符合率分别为91.2%、90.5%和80.0%.     

从业人员预防性健康体检沙门/志贺氏菌检验PCR方法快速筛查的应用

采用实时荧光定量PCR方法快速检测食品等从业人员肠道致病菌,并与培养法进行比较,了解实时荧光定量PCR方法的应用价值.方法:随机采集96 752份从业人员肛拭子标本分别进行实时荧光定量PCR方法和培养法检测沙门氏菌和志贺氏菌,比较两种方法对两种肠道菌的检出率.结果:96 752份标本中,实时荧光定量PCR方法共检测出91份标本沙门氏菌阳性,其中83份分离阳性,41份志贺氏菌阳性,其中30份分离阳性.而传统培养法检测未检出.结论:实时荧光定量PCR方法可以很好的应用在从业人员肠道致病菌的筛查,并且可以提高从业人员肠道致病菌的检出率和准确性,节省劳动力,降低工作人员的工作强度.     

牦牛德尔卑沙门氏菌的分离、鉴定及致病性研究

为调查四川省阿坝州红原县牦牛腹泻病因,本课题组从红原县4所养殖场采集牦牛腹泻粪便16份,并对分离株进行多位点序列分型、血清型鉴定、耐药性试验及小鼠致病性试验.结果表明：16份样品共计分离出16株沙门氏菌,均为德尔卑沙门氏菌ST71型,100%菌株对四环素、氨苄西林、氯霉素和头孢噻呋多重耐药;选取腹泻较严重牦牛粪样沙门氏菌分离株（编号15XLR）进行致病性试验,得出分离株15XLR的半致死剂量为1.2×107 CFU,病理切片结果显示小鼠后脾脏、肠道损伤严重.本研究对红原县牦牛腹泻病因进行了调查研究,并证实德尔卑沙门氏菌除感染猪鸡外,其能够入侵牦牛机体,提示牦牛腹泻疾病的防控应注重沙门氏菌的感染以及在牦牛群体中的传播.     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

试用生化编码系统检测进口粉类农产品中的沙门氏菌

参照生化编码系统的鉴定方法从进口粉类农产品中筛选出7株沙门氏菌,其中从熟猪油渣检出5株(检出率100％),鳗鱼饲料检出1株,猪浓缩饲料检出1株。所有被检出的沙门氏菌皆可被0_(a-f)多价血清凝集,进一步的血清学试验鉴定出4个血清型,分别为乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi B.)、丙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi C.)、德比沙门氏菌(S.derby)和阿贡纳沙门氏菌(S.agona)。初步认为该生化编码系统适合于沙门氏菌的筛选鉴定。     

鸡沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感试验

从新疆南疆地区某鸡场采集到的14份具有沙门氏菌病病变特征的病料中分离出沙门氏菌10株,通过形态观察、生化试验、血清学鉴定及动物致病性试验,结果表明,10株沙门氏菌的血清型为O2、O9,这两种血清型沙门氏菌对5日龄雏鸡具有很强的致病作用.药敏试验结果表明,沙门氏菌对硫酸庆大霉素最敏感,其次是头孢唑啉钠,敏感率分别为100%和90%,其对乙酰螺旋霉素和罗红霉素产生耐药性.     

耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的分离鉴定及生物学特性分析

以临床尿路感染患者尿液为研究对象,通过分离培养及16s rDNA进行肺炎克雷伯菌的分离鉴定;采用Kirby-Bauer纸片法进行药敏实验,并对分离株进行碳青霉烯酶表型筛选;通过PCR检测常见的碳青霉烯酶耐药基因、荚膜血清型和毒力基因分布情况;对分离的肺炎克雷伯菌株进行了生物被膜形成能力及其对小鼠致病力的分析。本研究从采取的86例尿液标本中分离检出11株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,分离率为12.79%。耐碳青霉烯酶基因PCR检测结果显示,blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaKPC基因在分离株中均呈现不同程度的分布。耐药性分析发现11株肺炎克雷伯菌对氨苄西林耐药率为90.91%,对头孢噻肟耐药率为63.64%,对链霉素、庆大霉素、氯霉素和诺氟沙星的耐药率较低。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜分型结果显示,分离的11株细菌中10株均为强毒力型菌株（90.9%）,其中K57血清型4株（36.4%）,K1血清型1株（9.1%）,K2血清型1株（9.1%）,K5血清型1株（9.1%）,K20血清型3株（27.3%）,提示该批分离株具有较强的致病力。此外,毒力因子分布结果显示,其毒力因子rmpA（54.5%）、Aerobactin F（54.5%）在菌株中分布较为广泛。生物被膜形成能力检测及小鼠致病性试验结果显示,9株分离株均有较强的生物被膜形成能力,菌株致病力可能与荚膜血清型及生物被膜形成能力相关。综上所述,临床分离的致尿路感染病原肺炎克雷伯菌呈现多重耐药特征,强毒力菌株以K57荚膜型为主,K1、K2均有分布,提示对尿路感染病原应加强耐药监测,合理使用抗菌药物,有效防控多重耐药和强毒力菌株的感染与流行。     

多种沙门氏菌分离培养基效果比较及在实验动物和垫料检测中的应用

摘要: 目的改进实验动物沙门氏菌分离培养方法,建立垫料中沙门氏菌检测方法。方法参考国内外沙门氏菌检测方法,用不同分离培养基对沙门氏菌、大肠杆菌和变形杆菌进行培养。选用最佳筛选效果培养基对动物肠道和垫料样品进行检测。结果BPW 预增菌、MKTTn 选择性增菌转种XLT4 培养基分离沙门氏菌的效果优于其他培养基,在1015 份动物样品中检测出3 份沙门氏菌阳性,能够检测出垫料中1CFU/g 的沙门氏菌。结论改进的沙门氏菌分离培养方法检出率高于现有国标方法,结果准确,可用于实验动物沙门氏菌及垫料的检测。     

重庆市水产品中副溶血性弧菌分离株的毒力基因研究

目的:了解重庆市副溶血性弧菌分离株的毒力基因、血清型以及耐药性,为防治副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供依据.方法:采用PCR方法检测溶血素基因,并结合药敏试验以及血清分型进行综合分析.结果:323份水产品样品中共分离出的35株副溶血性弧菌,其tdh和trh基因携带率分别为14.29%、2.86%,血清群主要为:O3群、O5群、O1群;14株临床分离株主要为O1群、O3群.两组不同来源的菌株均对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星敏感,对氨苄西林均有较强的耐药性.结论:重庆地区水产品中副溶血性弧菌的毒力基因携带率较低,但是血清型呈现多样性,且耐药性较严重,因此存在发生副溶血性弧菌食物中毒的潜在危险.     

鸡源沙门菌的分离鉴定及耐药性分析

为明确引起宁都黄鸡沙门菌病的菌株的血清型和耐药情况,经疑似沙门菌病死亡鸡中分离细菌、PCR法鉴定细菌种属和血清型,纸片法分析其药物敏感性.结果 分离到4株沙门菌,均为鼠伤寒沙门菌.4株细菌同时敏感的药物有头孢噻肟、氟哌酸、多粘菌素B,4株细菌同时耐受的药物有阿莫西林、四环素、强力霉素.结果 提示,近期预防和治疗35日龄内发病宁都黄鸡沙门菌病的优选药物是头孢噻肟、氟哌酸和多粘菌素B等.     

西藏地区牦牛源沙门菌分离鉴定、血清分型及致病性研究

本研究旨在了解西藏地区牦牛源沙门菌流行情况、分布情况和血清型种类.通过采集西藏全区七地市牦牛腹泻粪便,利用细菌培养特性、生化特性和分子生物学方法对样品中细菌进行分离鉴定,再根据血清特异性凝集对分离菌株进行血清分型,最后利用动物感染试验和动物组织HE染色法了解菌株致病性强弱.结果表明：西藏全区共分离出50株沙门菌,检出率为25.13%（50/199）.其中,拉萨、昌都和山南三地分离率相较于其他四地较高,阿里地区分离率最低;血清型分型结果显示,共分离出B群、C1群、C2群、D群4种血清群,包含都柏林沙门菌、伤寒沙门菌、阿邦尼沙门菌等血清型共18种血清型.按血清群统计结果显示,4种血清群中,以D群所占血清菌株最多,为常见血清群;50株沙门菌种以都柏林沙门菌为优势血清型,占所有菌株的20.00%（10/50）;从各地区沙门菌分型结果显示,各地区所占血清群、血清型数量均不相同.致病性试验结果显示：牦牛源都柏林沙门菌感染KM小鼠的LD₅₀为0.368×10⁸CFU/mL,属强致死性菌株;组织HE染色观察结果显示牦牛源都柏林沙门菌可引起宿主全身性损坏,其中...     

针对不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株的agr Ⅰ-Ⅳ分型初探

目的:金黄色葡萄球菌附属基因调节子(agr)位点是一个全面的群集感应系统并且控制着毒力因子的产生,本研究旨在针对不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株进行agr Ⅰ-Ⅳ基因分型研究.方法:根据金黄色葡萄球菌agrⅠ-Ⅳ基因组别类型的引物,对五种不同来源的169株金黄色葡萄球菌DNA模板进行多重PCR扩增,获得目的基因,以判断agr基因型.结果:169株分离菌株中,agrⅡ型的检出率为19%(32/169),agrⅢ型检出率为12%(20/169),agrⅣ型检出率为8%(14/169),五种不同来源的金黄色葡萄球菌均有检出agrⅡ型,均未检出agrⅠ型,并且都含有未能分型的agr阴性菌株.研究结果表明不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株中agr Ⅰ-Ⅳ基因型的流行情况.该方法对于金黄色葡萄球菌菌株分子分型有一定的借鉴意义,也为金黄色葡萄球菌菌株分子流行病学调查奠定一定的基础.     

针对不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株的agr I-IV分型初探

目的: 金黄色葡萄球菌附属基因调节子(agr)位点是一个全面的群集感应系统并且控制着毒力因子的产生, 本研究旨在针对不同来源的金黄色葡萄球菌分离菌株进行agr I-IV基因分型研究. 方法: 根据金黄色葡萄球菌agrI-IV基因组别类型的引物, 对五种不同来源的169株金黄色葡萄球菌DNA模板进行多重PCR扩增, 获得目的基因, 以判断agr基因型. 结果:169株分离菌株中, agrⅡ型的检出率为19%(32/169), agrⅢ型检出率为12%(20/169), agrⅣ型检出率为8%(14/169), 五种不同来源的金黄色葡萄球菌均有检出agrⅡ型, 均未检出agrⅠ型, 并且都含有未能分型的agr阴性菌株. 研究结果表明不同来源金黄色葡萄球菌分离菌株中agr I-IV基因型的流行情况, 该方法对于金黄色葡萄球菌菌株分子分型有一定的借鉴意义, 也为金黄色葡萄球菌菌株分子流行病学调查奠定一定的基础.     

MIRU技术在石河子地区部分结核杆菌基因分型聚类分析中的初步应用

目的采用结核杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)分型技术,对石河子地区结核杆菌临床分离株进行基因分型及聚类分析,初步筛选可用于石河子地区结核杆菌临床分离株基因分型的MIRU位点。方法以本实验室保存的结核杆菌临床分离株基因组DNA为模板,采用PCR技术与核酸凝胶电泳技术,分别对7个MIRU位点进行检测,计算分辨指数,应用ntsys2.10e软件对菌株基因型进行聚类分析。结果石河子市33株临床分离株有22种基因型,均与结核杆菌标准株(H37Rv)不同;在石河子地区结核杆菌临床分离株的7个MIRU位点中,分辨率高的位点有1个(MIRU26);中等有2个(MIRU10,MIRU16);低的有3个(MIRU23,MIRU39,MIRU40);有一个位点分辨率为0(MIRU27);石河子地区分离株总HGI指数为:0.966。结论本实验选取的7个MIRU位点中有3个(MIRU26,MIRU10和MIRU16)可用于石河子地区结核杆菌临床分离株初步基因分型。     

21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的PCR检测

为检测某鸡场21日龄鸡胚金黄色葡萄球菌感染情况, 针对其特有的耐热核酸酶基因(Nuc)设计并合成1对引物进行PCR扩增, 建立特异性检测金黄色葡萄球菌的PCR方法. 对18个21日龄鸡胚培养、分离, 获得18株疑似金黄色葡萄球菌菌落. 用建立的PCR方法对18份疑似样品进行扩增获得4份金黄色葡萄球菌的阳性扩增, 证实该鸡群21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的感染率为22%(4/18). 本文中基于Nuc基因建立的PCR检测方法是检测鸡胚中金黄色葡萄球菌快速、特异的分子生物学方法.     

食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏菌invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术（LAMP）,分别对7种不同血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增,同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活菌计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336,mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25,g-1.所建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏菌污染食品的快速检测.     

实验大鼠和小鼠绿脓杆菌分离株的鉴定和血清分型研究

目的了解上海、江苏实验大鼠和小鼠绿脓杆菌的感染状况及血清型分布情况。方法 2013年7月—2015年5月,从上海、江苏59个实验动物设施采集实验大鼠和小鼠的回盲部内容物进行绿脓杆菌分离、细菌形态、生化特性、16S rRNA基因序列和血清型分析。结果从20个设施分离到67株绿脓杆菌,生化鉴定和PCR试验结果均符合绿脓杆菌特征。血清型分析显示E型(17株,占25.4%)和B型(14株,占20.9%)为主要血清型。结论本地区实验大鼠和小鼠存在绿脓杆菌感染,血清型分布较分散,无明显的流行特征。     

一种快速检测蛋鸡沙门氏菌的方法

为检测蛋鸡泄殖腔拭子中沙门氏菌,在基础培养基BPW的基础上,优化出了培养仅需6 h的选择性增菌液SEM;并根据蛋鸡泄殖腔拭子中的非沙门氏菌干扰菌种类,设计了沙门氏菌特异性检测引物hilAP3.结果表明：1)低数量(1~5 CFU/50mL)沙门氏菌在优化后的一步法选择性增菌液SEM中培养6 h 后,其生长量可达103 CFU/mL 以上,可满足 PCR方法的检测限(102 CFU/mL);2)hilAP3引物能排除蛋鸡泄殖腔拭子中的非目标菌的干扰,特异地检测其中的沙门氏菌;3)建立的SEM增菌6 h与hilAP3特异引物PCR联用的方法检测灵敏度为1~5 CFU/50mL,准确率为100%.因此,该研究中建立的优化增菌液与PCR联用法能在9h内完成沙门氏菌的检测,其灵敏度和特异性高,可应用于蛋鸡场的沙门氏菌检测.     

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

为调查川西北地区牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况,对采自川西北甘孜州和阿坝州的26份腹泻牦牛粪便样品进行大肠杆菌分离,分别以分离的大肠杆菌DNA和牦牛腹泻粪便样本提取的总DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,分析产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻中存在情况,同时比较两种DNA提取方法对产肠毒素大肠杆菌PCR检出率的差异;以分离自外表健康牦牛粪便的105株大肠杆菌DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,比较牦牛源产肠毒素大肠杆菌在外表健康牦牛和腹泻牦牛中的携带情况.结果:从26份牦牛腹泻粪便样本中共鉴定出84个大肠杆菌菌落携带K99菌毛基因,这些菌落分别来自所有26份牦牛腹泻样品,因此,牦牛腹泻样本100%分离并检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌;而粪便总DNA检测结果为K99+菌毛基因阳性率84.62%(22/26),粪便中提取的总DNA模板K99+菌毛基因PCR检出率略低于分离鉴定的细菌DNA检出率;105株外表健康牦牛粪便样本分离株中检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌34株,检出率为32.38%(34/105),产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康牦牛粪便的检出率(P0.001).结果表明,产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中存在广泛,是引起牦牛腹泻的一种重要病原菌;以粪便中提取的总DNA为模板,可快速检测牦牛粪便中产肠毒素大肠杆菌的存在.     

美洲雁源金黄色葡萄球菌的PCR检测

本试验对从临床病死美洲雁的病料中分离得到的一株致病菌进行了16s rRNA基因片段的扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接构建克隆载体,经PCR和酶切鉴定正确后测序,测序结果与GenBank中已注册菌株的16s rRNA基因序列进行同源性比较,结果与金黄色葡萄球菌的序列同源性达到97%.由此判定感染病鸭的是金黄色葡萄球菌.