细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

研究在成熟液中添加表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）以及成熟时间对牦牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响,以确立牦牛卵母细胞体外成熟的最佳体系.结果表明,成熟液中添加EGF组的成熟率明显高于未添加组（P＜0.05）,并且牦牛卵母细胞的成熟率随着EGF添加的浓度增加也不断上升;随着体外培养时间的延长,成熟率逐渐增加,培养24 h后成熟率趋于稳定;胚胎体外培养液中添加EGF能显著提高孤雌胚胎的8-细胞和囊胚形成率（P＜0.05）.由此推测：在体外培养22-24 h,且添加40 μg/mL EGF最有利于牦牛卵母细胞体外成熟;胚胎培养液中添加40μg/mLEGF能显著提高牦牛孤雌胚胎的体外发育能力.     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

牛卵母细胞不同时间的成熟培养可提高核移植效率

：比较了成熟培养不同时间的卵母细胞的成熟率、去核率及用于核移植的效率,认为成熟培养21 h的卵母细胞虽然有较高的成熟率,但不适于采用盲去法去核.成熟培养19 h的卵母细胞核移植效率略高于成熟培养17 h.因此认为采用盲去法去核操作大批卵母细胞时,19 h的体外成熟培养时间是比较适宜的.     

年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响

为研究卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了年龄、成熟方式及培养液对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响.1.5月龄、3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠的GV期卵母细胞其体外成熟率无差异(P0.05).经人工活化后,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率都明显降低;体外成熟的生长在HTF培养液的卵母细胞发育到2-细胞期胚的比率(44.4%)显著高于生长在M16培养液的比率(22.9%)(P0.01).结果表明昆明白小鼠卵母细胞的体外成熟不受年龄影响,体外成熟的卵母细胞人工活化后支持发育的能力比体内成熟的差,HTF培养液更适合小鼠卵母细胞人工活化后的进一步发育.     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

不同培养液对卵母细胞体外成熟及重组卵母细胞孤雌活化的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了几种培养液对GV期卵母细胞体外成熟和重组卵母细胞孤雌活化的影响.自然获得的GV期卵母细胞和经显微操作获得的重组卵母细胞在M2、HTF和M199培养液培养,其体外成熟率无差异(P&gt;0.05);但成熟的重组卵母细胞经人工活化后,生长在HTF培养液的细胞发育到2-细胞期胚的比率(49.2%)明显高于生长在M199培养液的比率(28.9%)(P&lt;0.05).结果表明HTF培养液更适合小鼠卵母细胞的体外成熟和进一步发育.     

牛胚胎体外生产技术的应用研究

利用屠宰牛卵巢抽出的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验，结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００－２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞标准密度培养，其卵裂率和囊胚发育率没有显著变化，体外授精时间可从成熟培养后２２小时延长至２７小时，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化。卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留孵丘细胞再培养４８小时形     

体外培养绵羊卵母细胞超微结构的变化

实验利用透射电镜研究了根据卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后类绵羊卵母细胞在体外成熟增培养前后超微结构的变化,结果表明,小卵泡卵经过体外培养其线粒体、皮层颗粒等细胞器均未达到熟卵母细胞中这两种超微结构的分布状态;大、中两类卵泡卵经过体外培养细胞成熟较好,     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育的比较

目的对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活,可以间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%,17.7%)明显高于体外成熟21 h或24 h的囊胚发育率(12.3%,13.8%);Ion联合6_DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同培养条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(21.7%,13.0%)。     

旁分泌因子促进家畜卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的研究

1984年,旭日干先生在日本成功培育出世界首例试管山羊,开创了体外受精技术引领的家畜品种改良新时代.之后,旭日干先生带领内蒙古大学科研团队,在1989年培育出了中国首例首批试管牛和试管羊.在此基础上,人们不断优化体外卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的技术路线,摸索出更高效的试管动物制备方法.卵母细胞体外成熟技术是制备试管动物的关键技术之一.在生理条件下,卵巢内的卵母细胞成熟过程受到众多激素和旁分泌因子的调控.人们通过在体外培养体系中添加相应的激素和旁分泌因子,以期提高卵母细胞体外成熟效率.最近,我们发现,旁分泌因子GDNF可以提高牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育效率;CTGF,SDF-1,HGF,NGF四种因子的组合使用可以提高绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育效率.本文将综述这些旁分泌因子对卵母细胞成熟和胚胎发育的促进作用,并提出相关领域未来的研究和应用方向.     

"两步法"体外培养山羊卵母细胞的初步研究

体外成熟培养的卵母细胞经本外受精后，囊胚发育率远低于体内成熟卵母细胞，原因之一是由于体外成熟卵母细胞的不充分获能造成的，有假说认为：卵母细胞在体外培养过程中，如果延长GV期，可促进卵母细胞进一步获能，从而提高发育潜能。本文以山羊卵子为研究对象，探讨了山羊卵泡各种成分以及异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制以及抑制解除后减数分裂的影响，结果显示，山羊50％Q卵泡液、100％卵泡液、半卵泡、打孔整体卵泡以及完整卵泡对山羊卵母细胞的核成熟抑制率分别为：0.00%、9.38%、60.47％、78.26%和70.09%，随后，对经山羊半卵泡、打孔整体卵泡、完整卵泡抑制培养后的卵子进行恢复培养发现，卵子核成熟率分别为：64.29%、3.49%和4.13%，山卵母细胞与半卵泡共培养24h后进行0h、12h、20h、24h和30h的恢复培养，核成率分别为：0.00%、20.00%、61.90%、64.29%和43.75%，表明山羊半卵泡可以有效抑制山羊卵母细胞使之处于GV期，并且这种抑制作用可以恢复，恢复培养时间以20h和24h较为适宜，初步研究异种家畜卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制的影响发现，50％牛卵泡液、1005牛卵泡液、50％绵羊卵泡液、100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制率分别为3.7%、21.88%、10.00%、58.82%，表明，100％绵羊卵泡液对山羊卵母细胞核成熟抑制效果较好。     

卵巢运输条件对牦牛卵母细胞质量与胚胎体外发育的影响

卵巢的运输条件是影响卵母细胞的质量与胚胎发育的主要因素之一.为了找到牦牛卵巢的最佳运输温度,将采集的新鲜牦牛卵巢分别置于15-20℃、25-30℃、35-40℃的生理盐水中,1-2 h送回实验室,比较不同运输温度下的可利用COCs回收率、卵母细胞成熟率、孤雌激活与体外受精胚胎的体外发育.结果表明35-40℃运输卵巢能显著提高牦牛可利用COCs回收率(72.0％),但25-30℃组卵母细胞成熟率与其它组差异显著(78.9％);25-30℃组的卵母细胞进行孤雌激活与体外受精后,8细胞和囊胚形成率显著高于其它组(P＜0.05).由此推测:25-30℃为牦牛卵巢的最佳运输温度,能显著提高卵母细胞质量与胚胎体外发育能力.     

富勒烯及其衍生物对小鼠卵母细胞成熟和激活的作用

为探索富勒烯及其水溶性衍生物对哺乳动物卵母细胞减数分裂的作用,使用富勒烯膦酸衍生物(2P)、富勒烯-PVP和富勒醇作用于体外培养的小鼠GV期卵母细胞和超排卵母细胞,通过观察第一极体排出率和原核形成率以判断卵母细胞的成熟和激活,并探讨光照对这一作用的影响.结果表明,在光照和非光照下,富勒烯的PVP水溶液、富勒醇对卵母细胞的成熟没有明显影响,而2P在光照下对卵母细胞的成熟和孤雌激活具有明显抑制作用,其作用有浓度依赖性.     

羔山羊卵巢卵母细胞超微结构及核质成熟分析

以ＦＳＨ－ＬＨ进行超排处理所得的羔山羊卵母细胞为材料，首次对羔山羊卵母细胞在体外成熟过程中的超微结构进行了探讨，并进行了细胞核质成熟的分析．结果表明：１）卵母细胞经体外培养０ｈ．１８～２０ｈ后，分别有１１．２％、７５．０％的卵发育至第二次减数分裂中期（ＭⅡ），表明羔羊超排卵泡卵母细胞在体外培养１８～２０ｈ以后，绝大部分卵子的细胞核已成熟；２）透射电镜（ＴＥＭ）结果表明，０ｈ卵母细胞内皮质颗粒（ＣＧｓ）分散于细胞质内，但有时也以簇的形式存在．体外培养１８～２０ｈ后，ＣＧｓ数量增多，大多都定位于接近质膜的胞质中，呈单层排列，根据这种ＣＧｓ迁移现象判断的体外成熟卵母细胞质成熟率５０％，３）羔山羊卵母细胞内线粒体基质密度较浅，嵴很少，但经体外培养后部分线粒体中出现小嵴．细胞质中的内质网数目很少，通常以单个囊池形式存在；４）在部分卵母细胞质中脂滴和空泡数量增多，皮质颗粒消失．据此分析，体外培养０ｈ，１８～２０ｈ以后，分别有２５．０％和３１．３％卵子已出现退化现象．     

猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究

对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究.用盲吸法去核,体外成熟培养(IVM)39~41 h组卵母细胞去核率与IVM 36~38 h组差异显著(P<0.05),与42~44 h组差异不明显(P>0.05),但3组显著高于IVM 45~48 h组(P<0.05).化学诱导法去核结果,IVM 42~44 h组去核率最高,但与IVM 39~41 h组差异不显著(P>0.05),其他各组间均差异显著(P<0.05).在相同的体外成熟培养时间内,盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高.猪卵母细胞IVM在39~44 h内去核率较高,且盲吸法去核效率高于化学诱导去核.     

体外培养绵羊卵母细胞核质成熟的研究

实验通过研究卵母细胞的核相及皮层颗粒的分布,探讨按照卵泡大小和卵丘细胞层多少分类后的不同绵羊卵母细胞在体外培养过程中的核质成熟情况,结果表明：（１）小卵泡卵经体外２４ｈ后的核质成熟率分别为４５．９％和２８．２％,远低于大（９３．５％,６６．７％）、中（８５．１％,５１．０％）两类卵泡卵,２）大卵泡卵在体外培养２０ｈ已完成核质成熟,较中等卵泡提前４ｈ。３）ｇｋｐｈｅ ３ｎｆｃ ｃ ｈ ｇｃｆｔ ｐｎ     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的影响因素

随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入等高新技术的不断深入，人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加，卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。通过卵巢卵母细胞体外成熟获取大量成熟卵母细胞，然后进行体外受精、体外生产胚胎愈来愈引起人们的注视。对影响卵母细胞体外成熟的因素进行了综述。     

第一次减数分裂期小鼠卵母细胞的化学去核

过免疫荧光染色法确定了小鼠第一次减数分裂的进程,在此基础上分别用脱羧秋水仙碱和放线菌酮处理成熟培养的小鼠卵母细胞,抑制其纺锤体极间微管的延长和降低成熟促进因子的浓度,使其核物质随极体全部排出.结果表明:(1) 卵母细胞从有腔卵泡中分离时处于生发泡期,可见核仁;成熟2h内则全部发生生发泡破裂;培养5h,90%到达第一次减数分裂的前中期;培养8h,则33.3%处于中期;71.4%的细胞在成熟12h后发育为后期;第二次减数分裂的中期则于成熟培养15h发生.(2) 于成熟的不同时间取卵母细胞-卵丘细胞复合体进行去核处理后发现,体外成熟培养5h(即卵母细胞处于第一次减数分裂前中期时进行处理),其去核率最高,达85.6%;成熟5h之前各组随成熟培养时间的延长而去核率升高,之后各组则降低.(3) 比较卵母细胞-卵丘细胞复合体与自然裸卵去核率,后者效率为56%,显著低于前者(p＜0.05),因此该方法在卵母细胞-卵丘细胞复合体的完全去核率与传统的物理去核方法相当.