不同小鼠肝炎病毒对ELISA方法检测其血清抗体的影响

目的 建立小鼠肝炎病毒（Mouse Hepatitis Virus,MHV）血清抗体ELISA检测方法,用于本地区MHV的日常监测,以便对SPF小鼠感染状况及时作出判断。方法 选取3种MHV毒株MHV1、MHV-JHM和MHV-A59,通过L929细胞扩增培养获得纯化浓缩抗原并筛选适合包被抗原类型;免疫BALB/C小鼠,获得高效价免疫阳性血清;优化ELISA反应体系建立规范化的ELISA试剂盒并用于临床小鼠血清样品的检测。结果 筛选出适合本地区的MHV包被抗原类型为MHV1,建立了病毒扩增及浓缩纯化方法,制备的MHV抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为标准化质控血清。包被抗原、待检血清和酶结合物最佳工作浓度分别为4. 0μg/m L (10 -7. 73 /0. 1 m L TCID50)、1∶40和1∶4 000稀释;批次内和批次间平均变异系数分别为5. 13%和5. 57%;检测灵敏度为1∶4 000稀释;与小鼠仙台病毒（SV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼肠孤病毒III型（Reo3）、小鼠细小病毒（MVM）和鼠痘病毒（Ect）阳性血清均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于10%。对165份血清样品进行检测,阳性血清相符率97. 37%（37/38）,阴性血清相符率92. 19%（118/127）。结论 本研究建立的ELISA方法检测小鼠血清MHV抗体具有较高的特异性、敏感性和结果可重复性,可以用于本地区MHV日常病原学监测,以便对小鼠感染状况作出准确判断。     

基于小鼠肝炎病毒研究遗传工程小鼠隔离检疫设计

目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20) 28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。     

长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法的建立与应用

摘要: 目的建立长爪沙鼠仙台病毒( SeV) 抗体ELISA 检测方法,用于长爪沙鼠体内仙台病毒抗体的检测。方法孵育鸡胚,接种SeV,制备鸡胚尿囊液正常抗原和SeV 特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、精密性、稳定性实验。结果正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0. 1 μg /mL、2 μg /mL 和1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为9. 6% 和8. 4%,批间平均变异系数分别为9. 0% 和5. 9%; 检测灵敏度为1∶ 10 240; 与沙鼠小鼠肝炎病毒( MHV) 、小鼠肺炎( PVM) 、呼肠孤病毒3 型( Reo3) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA 方法特异性、敏感性强,重复性、稳定性好,检测结果,准确、可靠。可用于长爪沙鼠体内SeV 抗体的检测。     

猴B病毒BVgD-多肽ELISA检测方法的建立

目的建立猴B病毒抗体BVgD-多肽ELISA检测方法。方法以Western-blot分析猴B病毒糖蛋白D(BVgD)上的多肽抗原决定簇(BVgD-多肽)的抗原性,采用方阵滴定法,确定ELISA法的最佳实验条件。用灭活BV全病毒、HSV-1和BVgD-多肽三种抗原系统对猴血清样品进行平行检测,比较分析了三种系统的抗原性特点。并且将检测结果与美国BV抗体检测试剂盒的检测结果进行了比较。结果建立了猴B病毒抗体的BVgD-多肽ELISA法,研究结果表明本方法与BV全病毒和以HSV-1病毒为抗原的试剂盒相比,敏感性较低、特异性较好,避免了制备BV抗原对实验室要求高和HSV-1抗原引起的非特异性问题。检测结果与美国实验室BV抗体检测结果的符合率达85%。     

猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法的建立与初步应用

摘要: 目的 建立猫疱疹病毒Ⅰ型( FHV-1) 抗体 ELISA 检测方法,应用于临床样品中 FHV-1 抗体的检测。方法 培养猫肾传代细胞( CRFK) ,接种 FHV-1 病毒,制备 CRFK 正常抗原和 FHV-1 特异抗原,滴定山羊抗猫 IgG-HRP 和 抗原最佳工作浓度,并进行特异性、敏感性、稳定性及精密性实验。结果 正常抗原、特异抗原和酶结合物最佳工 作浓度分别为 0. 05 μg /mL、10 μg /mL 和 1∶ 5 000; 正常抗原、特异抗原批内变异系数分别为 8. 7% 和 5. 8% ,批间平均变异系数分别为 11. 9% 和 6. 6% ; 检测灵敏度为 1∶ 6 400; 与猫细小病毒( FPV) 、猫杯状病毒( FCV) 均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于 25% 。结论 建立的 ELISA 方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强,可用于猫 FHV-1 抗体的检测。     

ELISA检测姜片虫病患者抗体的研究

研究了姜片吸虫成虫冷浸抗原检测姜片吸虫病患者血清抗体的敏感性和特异性及其在流行病和临床上的应用价值．超声粉碎制备姜片吸虫成虫冷浸抗原．以评价ELISA法检测姜片虫病血清抗体的敏感性、特异性和交叉反应性．按常规ELISA方法操作,目视与酶标仪判断结果．普查2189人中姜片吸虫卵阳性者168例;168例中165例ELISA阳性,ELISA与改良加藤法的阳性符合率98．21％;健康居民血清147份,阳性6份,阳性率4．08％;与血吸虫病交叉阳性为9．38％,肺吸虫病交叉阳性为5．36％．姜片吸虫成虫冷浸抗原1：3500工作浓度包被酶标板,检测姜片虫病血清抗体具有敏感性高、特异强和交叉反应率低的特点．     

猴免疫缺陷病毒(SIV)双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制及应用

目的研制灵敏、特异的检测血清中猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)的双抗原夹心ELISA(dsELISA)诊断试剂盒并进行初步应用。方法采用原核表达系统表达并纯化的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)包膜蛋白(gp41)作为包被用抗原,建立dsELISA诊断方法。通过优化反应条件和筛选试剂,研制ELISA诊断试剂盒,经敏感性、特异性和重复性试验考核试剂盒的质量,并与美国BIORELIANCE公司试剂盒进行比较,将结果经美国VRL验证,判断本试剂盒与美国BIORELIANCE公司试剂盒两者之间的符合率。结果该试剂盒具有良好的灵敏度、稳定性和准确性。4℃条件下能保存8个月,与其他血清无交叉反应,与美国BIORELIANCE公司试剂盒检测结果的符合率为96%。结论研制成功的实验猴SIV ELISA检测试剂盒可用于临床检测。     

脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗体胶体金检测试纸条的研制

目的:为研制快速检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗体的胶体金试纸条.方法:以辛酸-硫酸铵沉淀法纯化脊髓灰质炎病毒Ⅰ型单克隆抗体,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,胶体金标记单抗,再结合脊灰病毒抗原形成复合物,固定于金标垫上,将鼠抗人IgG和羊抗鼠IgG分别包被于试纸条的T (检测线)处和C (质控线)处,应用该试纸条进行性能检测.结果:以已知的脊灰病毒Ⅰ型阳性血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为1:80;特异性试验证明该试纸条与甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒抗体阳性血清没有交叉反应;检测结果与脊灰病毒Ⅰ型疫苗抗体检测试剂盒(ELISA)试验的符合率为86.7%.结论:该试纸条检测脊灰病毒Ⅰ型的抗体水平具有较好的特异性与灵敏性,适用于大规模临床血清抗体水平检测,具有良好的应用前景.     

同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

猪圆环病毒Ⅱ型抗体检测ELISA试剂盒的制备

猪圆环病毒(PCV)两个血清型中只有PCV2为致病性病毒.将ORF2蛋白作为抗原建立区别两型PCV的血清学检测方法.去除N端信号肽的ORF2片段在大肠杆菌中BL21(DE3)中进行了表达.SDS-PAGE凝胶电泳表明在26 k D处有一个明显的表达条带,并且可以和猪圆环病毒阳性血清发生反应,表明重组蛋白表达成功.以表达的ORF2蛋白作为包被原,建立了检测猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA方法.与商品化试剂盒同时检验78份临床血清,符合率为95%;同时与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒均无交叉反应.     

禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

对6种禽流感病毒通用型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),PCR检测试剂盒进行比对与科学评价,为实验室采购提供依据。利用禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准品,鸡新城疫活疫苗与传染性支气管炎活疫苗对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对,并对97份临床样品进行了检测,筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。结果表明:A厂家试剂盒最低可检出1:100倍稀释的H7亚型标准品浓度,B厂家试剂盒最低可检出1:1倍稀释的H7亚型标准品浓度,C厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,D厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,E厂家试剂盒最低可检出1:1 000倍稀释的H7亚型标准品浓度, F厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,6种试剂盒特异性均良好。综上,E厂家试剂盒优于其他厂家试剂盒,可以作为动物疫病检测实验室在实施监测任务中的首要选择。     

免疫学与生化方法检测C反应蛋白相关性分析

为比较酶联免疫双抗体夹心法与生化免疫比浊法在检测C反应蛋白方面的差异,并进行相关性分析,分别利用4个厂家酶免方法的超敏C反应蛋白试剂盒(HS-CRP)和1种生化方法的普通C反应蛋白(CRP)作为考核试剂盒,选择21例低中高值样本,采用双盲法与参比试剂盒做临床平行比对并进行相关性分析.结果表明,与参比产品相比,免疫学方法检测HS-CRP具有高度相关性,并且有较好的检测低限.得出免疫学与免疫比浊法试剂盒有较好的临床相关性,能较好的满足国际上心血管事件风险评估新标准规定的1 mg/L以下为低风险区的检测需要的结论.     

动物源性食品的氯霉素ELISA检测及分析

采用酶联免疫法检测了730例天津口岸进出口肉制品、水产品、乳制品和蜂蜜等几种动物源性食品中的氯霉素含量,对阳性结果经液相色谱-质谱联用EEC Cy3.6 confirming method进行确证,分析了其残留现状,并对英国RANDOX公司氯霉素检测试剂盒从检测范围、B/B050%抑制浓度、板内变异、板间变异、样品添加试验、实际样品检测、稳定性等方面各项指标进行试验.结果表明,试剂盒的检测低限为0.1 ng/mL,线性范围为0.05～4.7 ng/mL,B/B050%抑制浓度为0.4 ng/mL,样品加标回收率为80.5%～110%,板内变异系数小于5%,板间变异系数小于10%,试剂盒稳定性好.     

AOZ化学发光酶联免疫检测试剂盒的研制

以呋喃唑酮代谢物(AOZ)和卵清蛋白(OVA)偶联物为包被抗原,与AOZ样品或标准品竞争呋喃唑酮多克隆抗体,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔抗体(IgG),研制AOZ的化学发光酶联免疫检测试剂盒。以鲁米诺-过氧化氢为发光底物进行化学发光酶联免疫检测。结果表明:试剂盒分析灵敏度为0.005μg/L,比传统的ELISA试剂盒高出一个数量级,拥有更低的检测限,批内变异系数为2.1%～7.9%,批间变异系数为5.2%～9.5%,批内回收率为93%～113%,批间回收率为94%～110%。与呋喃西林代谢物(SEM)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)及呋喃妥因代谢物(AHD)之间无明显交叉反应。此试剂盒可用于水产品中AOZ的检测。     

大小鼠主要病毒血清抗体检测结果与分析

目的评估清洁级大鼠、小鼠的微生物学质量。方法参照国家标准GB／T 14926-2001,依据单纯随机抽样 原则从相关单位生产繁殖群采集样品,检测主要病毒血清抗体水平。结果检测31只大鼠,其中仙台病毒(SV)和 汉坦病毒(HV)抗体阳性率均为0;检测280只小鼠,其中25只小鼠肝炎病毒(MHV)抗体阳性,10只小鼠仙台病 毒(SV)抗体阳性,1只小鼠鼠痘病毒(Ect)抗体阳性。结论清洁级小鼠的病毒监测工作及质量控制需加强。