甲醇浓度和VHb蛋白表达对重组毕赤酵母生产SAM的影响

以插入AOX1启动子调控S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶/VHb表达单元的重组毕赤酵母为对象,研究了甲醇浓度及vgb表达对茵体生长、SAM产量及SAM合成酶活力的影响,同时也考察了vgb表达对胞内ATP含量及细胞活性的影响.结果表明:甲醇浓度(?(CH3OH))由0.008提高至0.016后,可提高菌体浓度、SAM产量及单位菌体SAM含量;当?(CH3OH)=0.024时,SAM产量及单位菌体SAM含量与?(CH3OH)=0.016时相当,而菌体浓度稍低于?(CH3OH)=0.016时,高于?(CH3OH)=0.008时的菌体浓度.提高甲醇浓度导致SAM合成酶活力降低,细胞死亡率增加,说明在所考察的重组菌中SAM合成酶的活性并不是SAM合成的限制因素.在上述3种甲醇浓度时,透明颤菌血红蛋白VHb表达都改善了细胞活性,并在较高甲醇浓度(0.016和0.024)时提高了胞内ATP含量.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达情况,结果显示:当采用含Nus.Tag融合标签的pET-44a为载体,trxB和gor双突变的Ori-gami为宿主时最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)SAM合成酶的可溶性时,也得到了相似的结论;比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9U/mg。     

酿酒酵母2B-39 sam 2在大肠杆菌中的克隆及表达

构建S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam2)的基因工程菌,为S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的工业化生产提供参考。应用PCR技术从酿酒酵母的总DNA中扩增出1.2kb的sam2,构建重组载体pET28a-sam2,将其转入大肠杆菌进行表达和分析。SDS-PAGE显示重组克隆表达的SAM2分子量约47kD,重组蛋白量约细菌总蛋白的20.1%,酶活达到19.6nmol/(h.mL),大肠杆菌表达出了具有生物活性的sam2。     

重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素α2b

通过培养重组大肠杆菌BL21(pBAI)表达人干扰素α2b(Human Interferon α2b,hIFNα2b).hIFNα2b表达由PL,启动子控制,通过升温至42℃诱导表达.本研究比较了分批培养和多种补料分批培养方式下hIFNα2b的生产,其中通过恒速流加葡萄糖,hIFNα2b的表达量达到6 540 mg/L,平均生产速率和比速率分别为546 mg/(L·h)和27 mg/(g·h).升温前1.5 h补充25 g酵母提取物,并以0.27 g/(g·h)的比速率供应葡萄糖,hIFNα2b的平均生产速率达到1 006 mg/(L·h),比生产速率为54 mg/(g·h),对有机氮源的得率提高到138 mg/g.     

SAM合成酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术从S.cerevisiae TCCC 31012菌株的染色体DNA中扩增得到S-腺苷甲硫氨酸合成酶-2基因(sam2),将sam2克隆到酿酒酵母表达载体pACT2的强启动子PADHI控制下,以构建高效表达质粒,并在酿酒酵母亮氨酸缺陷型茵株YS58中表达.重组质粒经鉴定含有sam2基因.工程菌YS58-2表达产物经SDS-PAGE,结果显示重组菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的分子质量约为43ku,经凝胶电泳扫描,表达带约占菌体总蛋白的14%.YS58-2菌株培养72 h的SAM合成酶活力为16.5 U/mg茵体蛋白,较出发菌S.cerevisiae TCCC 31012提高了40.3倍,较受体菌YS58提高了32倍.     

复合诱变和原生质体融合选育S-腺苷甲硫氨酸酿酒酵母高产菌株

对生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体融合。采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的单倍体菌株hR10,对其进行UV和DES复合诱变,筛选出了4个单倍体正突变株DR1-3、NM14、NM39和NM45。制备了单倍体正突变株的原生质体,采用热灭活和UV灭活法灭活双亲原生质体,在聚乙二醇（PEG）的诱导下进行原生质体融合,筛选得到融合子F35,其生产 SAM的产量为22.5 mg/L,与出发菌株R1（11.1 mg/L）相比,提高了103%,并且能够稳定遗传。采用正交试验优化了F35发酵生产SAM的培养基和发酵时间,优化了的培养基配方为麦芽糖100 g/L,蛋白胨10 g/L,NH₄H₂PO₄4g/L,NH₄Cl₅g/L,MgSO₄0.1g/L,KH₂PO₄6 g/L,发酵时间为72h。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的表达情况,结果显示:采用含Nus·Tag融合标签的pET-44a为载体,trx B和gor双突变的Origami为宿主最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的可溶性时,也得到了相似的结论,比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9 U/mg。     

前体氨基酸对维生素B_(12)发酵合成的影响

谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸是维生素B12合成的重要前体。在脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrifican)发酵的产物合成期以补加的方式考察了这4种氨基酸对维生素B12合成的影响。在合成培养基的基础上,通过单因素添加试验分别考察了这些氨基酸对维生素B12合成的影响,发现谷氨酸、甘氨酸和苏氨酸影响显著;并进一步利用三因素三水平的正交试验设计考察了氨基酸混合添加对菌体生长和维生素B12合成的影响,结果表明谷氨酸是最主要的影响因素,并且发现同时添加多种氨基酸更有利。当添加量为谷氨酸0.45 g/L、苏氨酸0.20 g/L、甘氨酸0.15g/L时,得到的菌体量和维生素B12产量分别比对照组提高了13.1%和46.0%。     

盐地碱蓬甲硫氨酸合成酶基因(SsMS)的克隆与表达分析

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了甲硫氨酸合成酶基因的cDNA片段 .通过Southern杂交和Northern杂交对其表达特性进行分析 ,结果表明 ,同一盐浓度不同时间处理下、双氧水及冷害刺激条件下甲硫氨酸合成酶在碱蓬叶中的表达量先呈现减少然后增加的趋势 ;聚乙二醇 (PEG)透导下呈现下降趋势 .由此可见该酶在盐、氧化和低温胁迫条件下产生一定的反应 .     

Ag/聚L-甲硫氨酸复合修饰电极的制备及其用于果蔬中维生素C的测定

采用循环伏安法将Ag和L-甲硫氨酸(L-Met)聚合在玻碳电极表面,制得Ag/聚L-甲硫氨酸复合修饰电极(AgPLM/GCE),并对维生素C在此电极上的电化学行为进行研究,建立测定维生素C的新方法。在pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液中,扫描速率为220mV/s时,维生素C在修饰电极上,产生一灵敏的氧化峰,峰电位为0.326V(s Ag/AgCl),峰电流与维生素C的浓度在2.00×10-4~3.00×10-2 mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为5.00×10-6 mol/L。用于部分水果蔬菜中维生素C的测定,结果满意。     

响应面法优化海洋细菌NTa产琼胶酶的发酵条件

利用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面法,对培养基组成、培养条件对Stenotrophomonas sp .NTa发酵产琼胶酶的影响进行分析并优化,研究该菌株发酵产酶的动态规律,并利用薄层色谱和MALDI-TO-MS进行酶解产物的鉴定。结果显示,在琼脂、酵母浸膏、CaCl2、MgSO4·7H2O、培养基的初始pH值、装液量、接种量几个因素中,酵母浸膏和培养基初始pH值对菌株NTa产琼胶酶具有显著影响,在含有1.03%酵母浸膏、初始pH=8.0的基础发酵培养基（NaCl、KNO3、MgSO4·7H2O、CaCl2、K2HPO4、FeSO4·7H2O、琼脂的质量浓度分别为50,5.0,5.0,0.2,0.1,0.02,2.0 g/L）中可获得最高的琼脂酶活力。菌株在28 ℃、180 r/min条件下发酵时,对数生长中后期快速合成琼胶酶。发酵48 h,琼胶酶活力高达2.688 U/mL。酶解72 h的产物分析结果显示,菌株NTa琼胶酶水解琼脂主要产生四糖。     

一株高温蛋白酶高产菌株产酶条件的优化

对一株高温蛋白酶高产菌株枯草芽孢杆菌BY25的发酵培养基组成与产酶条件进行了优化。正交试验结果显示培养基中各因子对产酶影响从高到低为:豆饼粉、葡萄糖、硫酸镁、麸皮、磷酸氢二钠、氯化钙。在此基础上进行培养基组成优化,将豆饼粉、麸皮混合氮源改为以豆饼粉为单一氮源进行蛋白酶发酵。单因素试验发现,在单一氮源培养条件下,培养基中各因子对产酶影响从高到低依次为:豆饼粉、葡萄糖、氯化钙、磷酸氢二钠。除微量氯化钙外,金属盐,尤其是金属硫酸盐的添加对产酶有显著抑制作用。此外,培养初始pH和培养时间对产酶有显著影响,接种量也有一定影响。通过绘制120 h产酶曲线发现,BY25产酶曲线为双峰,产酶曲线顶峰出现在发酵后72 h,优化后BY25发酵培养基各组分添加量为豆饼粉60 g/L、葡萄糖60 g/L、氯化钙 0.5 g/L、磷酸氢二钠 4 g/L,接种量为4.5%～5%,初始培养pH为8.0。优化产酶培养基和产酶条件后,发酵液酶活力可达到101.1 μmol/(min·mL)。     

酶法水解V_C磷酸酯镁及其动力学分析

考察酶法水解VC磷酸酯镁(Magnesium Ascorbyl Phosphate,MAP)过程,采用复合磷酸酯酶(Phosphoesterase Complex,PC)为催化剂,以水解产物VC的含量(水解率)为指标考察底物浓度、反应时间、pH值、反应温度、酶用量等因素对MAP水解程度的影响,选择最佳水解条件并对其进行动力学分析。结果表明,在底物MAP的质量浓度为1.72g/L、酶和底物的体积分数为5%、温度37℃、pH 5.5条件下水解4h,水解率最大,可达(32.64±0.42)%。动力学分析表明:水解动力学符合米氏方程,其中km=25.82g/L,vmax=126.26g/(L.h)。     

The start-up of biohydrogen-producing process by bioaugmentation in the EGSB reactor

Expanded granular sludge bed (EGSB) reactor and bioaugmentation were employed to investigate biohydrogen production with molasses wastewater. The start-up experiments consisted of two stages. In the first stage (0～24d) seeded with activated sludge, the butyric acid type-fermentation formed when the initial expanding rate, organic loading rate (OLR), the initial redox potential (ORP) and hydraulic retention time (HRT) were 10%, 10.0 kg COD/(m3·d), - 215 mV and 6.7 h, respectively. At the beginning of the second stage on day 25, the novel hydrogen-producing fermentative bacterial strain B49 (AF481148 in EMBL) were inoculated into the reactor under the condition of OLR 16. 0 kg COD/(m3·d), ORP and HRT about - 139 mV and 6.7 h, respectively, and then the reaction system transformed to ethanol-type fermentation gradually with the increase in OLR. When OLR, ORP and HRT were about 94.3 kg COD/(m3·d), -250 mV and 1.7 h, respectively, the system achieved the maximum hydrogen-producing rate of 282.6 mL H2/L reactor· h and hydrogen percentage of 51%～53% in the biogas.     

酸碱预处理对稻草秸秆发酵产氢的影响

随着环保要求的日益严格和化石能源的日益短缺,氢能作为清洁高效的可再生能源受到人们的普遍重视。厌氧发酵生物制氢是利用生物技术分解有机废弃物制备氢气,该工艺设备简单、操作容易、成本低廉等优点。以稻草秸秆为发酵底料,以厌氧活性污泥为接种物,研究酸碱预处理对秸秆发酵产氢的影响。结果表明,H2SO4预处理为最佳的预处理方式;稻草秸秆经1%的H2SO4预处理后发酵气中氢气的最大含量、最高比产氢速率和最高氢气产率分别为47.68%、4.67mL/(h.g)和59.21 mL/g;经1%的NaOH预处理后发酵气中氢气的最大含量、最高比产氢速率和最高氢气产率分别为41.92%、3.24 mL/(h.g)和42.02 mL/g;发酵液相中主要产物为乙醇、乙酸和丁酸。     

间歇出酶对里氏木霉产纤维素酶的影响

在分批补料的基础上,采用间歇出酶的方法,对里氏木霉产纤维素酶进行了研究。结果表明:分批补料过程中最佳的补料速度为5.5 g/(L·d),在此条件下产酶第8天滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力达到14.40 U/mL和1.59 U/mL。在分批补料的基础上进行间歇出酶,与对照相比,第4、6、8天出酶模式(模式1)时,总滤纸酶活力提高18.14%; 第4、7天出酶模式(模式2)时,总滤纸酶活力提高17.75%; 第5、8天出酶模式(模式3)时,总滤纸酶活力提高27.35%。研究表明,通过间歇出酶可以有效提高纤维素酶总滤纸酶的活力。     

碳氮比改变对崇明东滩湿地反硝化与硝态氮氨化的影响

【目的】分析自然和人为活动加速影响下沿海湿地土壤碳氮比变化对硝态氮还原过程的影响。【方法】以崇明东滩典型滨海湿地为例,采集4种不同覆被类型下沉积物样品,添加C₆H₁₂O₆或KNO₃溶液,使沉积物有机碳与硝态氮比例($C/NO_3^--N$)增大30%和减小30%,借助 ¹⁵N同位素稀释技术,研究反硝化(Den)与硝态氮氨化(DNRA)的变化特征。【结果】$C/NO_3^--N$的升高或降低均引起芦苇和互花米草覆被下沉积物Den和DNRA速率的显著下降(P<0.05)。芦苇覆被下Den速率从原土的10.1 μg/(kg·h)降至1.0~3.1 μg /(kg·h),互花米草覆被下Den速率从原土的3.4 μg /(kg·h)降至0.3~0.4 μg /(kg·h)。相比较而言,芦苇植被下DNRA速率从原土的21.9 μg /(kg·h)降至12.7~14.5 μg /(kg·h),互花米草覆被下从原土的42.6 μg /(kg·h)降至3.1~5.8 μg /(kg·h)。【结论】4种覆被下沉积物DNRA/Den值均大于1,表明DNRA是湿地硝态氮还原的主要途径。与$C/NO_3^--N$减小相比,$C/NO_3^--N$增大使$NO_3^--N$的还原更趋向DNRA过程。崇明东滩湿地$C/NO_3^--N$的波动(±30%)可能并不会导致沉积物N₂O排放的显著增加。     

一株耐高温L-乳酸高产菌的选育及其发酵特征

对鼠李糖乳杆菌菌株Lactobacillus rhamnosus JCM1553进行紫外诱变,选育得到一株耐高温L-乳酸高产突变菌GX-6.在47℃,分别以葡萄糖和木薯淀粉为底物,研究GX-6菌株发酵生产L-乳酸的情况并考察GX-6菌株的遗传稳定性.结果表明,以葡萄糖为底物时,发酵56h的L-乳酸产量达到117g/L,...     

丁酸梭菌产1,3-丙二醇的培养基优化

为提高丁酸梭菌(Clostridium butyricum)VPI 1718产1,3-丙二醇的能力,采用均匀设计试验和人工神经网络结合遗传算法对培养基进行优化,得到最优配方(g/L):废甘油70,酵母粉2.0,KH2PO4 0.6,K2HPO4 1.2,(NH4)2SO42.6,MgSO4 0.2;使用该培养基在5 L发酵罐中分批培养14 h丁酸梭菌后,1,3-丙二醇质量浓度为33.0g/L,转化率为55.3%,生产强度为2.36 g/(L·h),较优化前分别提高了32.5%,7.17%和33.3%.     

癸酸抗性突变株流加发酵法生产达托霉素

采用He-Ne激光对达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌LC-54进行诱变,筛选前体癸酸抗性突变株,在此基础上进一步考察了一次补料、间歇补料和恒速流加补料等不同补料策略对达托霉素发酵生产的影响．结果表明,选育前体癸酸抗性突变株可以提高达托霉素的生产能力,并最终获得了达托霉素发酵效价较出发菌株提高了37．2%的高产突变株LC-KS-54．采用恒速流加策略,能够有效地提高达托霉素产量,经过130 h的恒速流加培养,细胞干重达到15．4g/L,达托霉素产量达到258 mg/L,明显优于其他前体补料策略．