雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究

【目的】建立雄性二倍体毛白杨再生体系,构建稳定的遗传转化方法,为进一步研究毛白杨基因功能提供试验平台。【方法】以雄性二倍体毛白杨的幼嫩茎段和叶片为外植体,1/2 MS为基本培养基,通过调整6-BA、IAA和TDZ激素浓度进行再生体系筛选;采用农杆菌EHA105介导叶盘法,控制预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和卡那霉素筛选浓度,进行遗传转化;以幼嫩叶片原生质体为受体细胞,PEG介导转化荧光标记基因EGFP,进行瞬时表达。【结果】雄性二倍体毛白杨再生过程包括继代、芽伸长和生根3个阶段,其培养基组分分别为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005 mg/L TDZ、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和1/2 MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA,该条件下生根率为96.7%,增殖系数为4.47。遗传转化过程包括预培养、农杆菌侵染、共培养、抗性筛选和生根5个阶段,其中预培养为12 h、农杆菌浓度OD₆₀₀为0.4、侵染时间为20 min、共培养时间为24 h、卡那霉素(30 mg/L)筛选45 d和抗性苗生根20 d。试验共获得86株抗性植株,其中14株分子鉴定结果为阳性。在40% PEG4000的介导下,EGFP基因瞬间转化效率为50%。【结论】雄性二倍体毛白杨再生周期短、遗传转化稳定,是杨树基础研究的理想材料。本研究拓宽了杨树遗传转化体系,为杨树分子辅助育种提供了新途径。     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.     

根癌农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化体系的研究

采用农杆菌介导法,对骏枣愈伤组织遗传转化体系进行研究.结果表明：进行遗传转化的合适条件为：愈伤诱导培养基MS＋6-BA 0.4 mg/L＋2,4-D 1.2 mg/L;浸染之前对愈伤组织进行6d的避光培养可提高愈伤组织在共培养过程中的成活率;愈伤组织在OD600=0.4～0.6的农杆菌菌液中浸染10 min,农杆菌LBA4404的生长情况最好;在28℃黑暗条件下共培养放置16 d对转化最适宜;头孢霉素的抑菌浓度为250 mg/L;卡那霉素的筛选浓度为125 mg/L.经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到骏枣基因组中,初步实现了农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化,与以骏枣茎叶外植体建立的遗传转化体系相比,以骏枣愈伤组织为外植体共培养时间长,有利于转化.     

农杆菌介导的棉花遗传转化过程中诸因素对出愈率的影响

研究了农杆菌介导的棉花遗传转化过程中影响外植体出愈率的一些相关因素.结果表明:卡那霉素(Kan)的浓度以50 mg/L或75 mg/L为最好,农杆菌菌株EHA105的浸染能力较强,7 d苗龄的棉花无菌苗下胚轴为最佳的遗传转化外植体材料,下胚轴外植体经预培养后再经农杆菌菌液浸染更有利于胚性愈伤组织的形成,同时农杆菌菌液浸染时间以3 min为最佳.     

西瓜NPR1抗病基因的遗传转化

比较了不同预培养时间、侵染时间、共培养时间等因素对农杆菌转化西瓜的影响。西瓜遗传转化的适宜条件:3 d苗龄的子叶,预培养1 d,农杆菌侵染10~15 m in,共培养3 d;不定芽与根的潮霉素(Hyg)筛选浓度分别为20 m g.L-1和6 m g.L-1。对20株西瓜转化苗进行DNA提取,PCR检测,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。     

根癌农杆菌介导遗传转化烟草‘NC89’效率的影响因素（英文）

【目的】通过农杆菌介导将PBI121:CslA1基因转入烟草‘NC89’,研究遗传转化的影响因素,旨在提高转化效率,优化相关技术。【方法】通过培养基的筛选在MS培养基+6-BA(2.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L)获得了大量的幼苗,以其作为转基因受体材料,通过控制农杆菌浓度、预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间等条件,进行含卡那选择性培养基的筛选,获得转基因壮苗。【结果】最佳的转基因植株培养方法为:共培养2 d以后,农杆菌的浓度D600为0.7,农杆菌诱导20 min,培养基的卡那质量浓度为100 mg/m L;暗培养4 d易于提高再生率,更换选择性培养基后暗培养7 d,更容易缩短愈伤诱导的时间。用RT-PCR和Southern杂交进一步验证和分析了转基因的结果。【结论】通过优化转基因的各环节条件,实现烟草的过量表达,提高了转基因的效率。研究结果可为农杆菌介导转化法在烟草及其相关植物的遗传转化应用提供参考。     

AgNO3对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响

以甘薯优良栽培品种“南薯88”为试材,研究了AgNO3对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响。结果表明,在预培养的培养基附加AgNO3不利于进行转化,而在共培养培养基中附加AgNO3则对转化有促进作用。当培养基中AgNO3的浓度为6mg/L时,卡那霉素抗性芽的获得率达最大值,为27．5％。文中还对AgNO3在甘薯遗传转化中的作用方式及在建立较简便、高效的甘薯遗传转化系统中的应用进行了讨论。     

抗除草剂Bar基因对小麦的遗传转化

作者通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒介导和基因枪法 ,将含抗除草剂Bar基因的植物表达载体 ,导入小麦幼穗和幼胚愈伤组织 .X Gluc染色检查表达载体中GUS标记基因的瞬时表达 ,并在含有除草剂Basta的培养基上进行多步筛选 .以愈伤组织为单位 ,统计GUS表达阳性频率和转化体的分化频率 .结果表明 :基因枪轰击法的平均转化率高于农杆菌导入法 ;幼穗作为受体的转化率高于幼胚 ;干燥处理有利于提高根癌农杆菌对小麦愈伤受体的浸染力 .     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

胞质雄性不育新基因T1243在大白菜中的遗传转化

以大白菜带柄子叶为外植体,通过农杆菌介导法,优化大白菜的遗传转化体系,得出结论:津育75的最佳筛选培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+7.0mg/L AgNO3+7.5mg/L Kan+200mg/L Amp,外植体在黑暗条件下预培养2d,然后用OD600值为0.1菌液侵染2min,共培养2d时转化率最高,为35.48%.对抗性植株进行分子检测,结果表明T1243基因已整合到大白菜中,并可以正常表达。     

Studies of Improving the Frequency of Indica Rice Transformation by Biolistic Bombardment

In order to improve the frequency of indica rice transformation by biolistic bombardment,suitable culture conditions for embryonic calli,an optimal selection scheme for resistant calli and seedling,and optimum bombardment parameters a investigated by using 14 commercially important indica rice cultivars.The main results show that the CC medium with 36g/L mannitol is a scheme subculture medium in which the browning of indica rice calli can be mitigated significantly;The concentration of 30-40mg/L Hyg or 150-200mg/L G418 or 10-20mg/L Basta is suitable for selection of resistant calli;The transformation parameters of 100μg gold powder absorbing 0.2μg DNA per shot and 900 psi helium pressure and 6 cm bombardment distance and bombarded twice for each plate give the best result;Keeping the target calli on osmotic medium containing 60g/L mannitol from 12-24h before bombardment to 24-48h after it can increase the efficiencies of transformation.Furthermore,some transgenic indica rice plants are obtained using this optimized transformation system.     

桑树遗传转化技术中抗生素的浓度优化研究

调查了抗生素对根癌农杆菌介导的桑品种“新一之濑”遗传转化不同培养阶段外植体生长、分化或生根的影响及其对农杆菌的抑制效果 ,并确定 :在叶盘 (或茎尖 )转化筛选培养阶段 ,Kan (卡那霉素 )和 Cab (羧苄青霉素 )适宜浓度分别为 3 0～ 40 mg/ L和 2 0 0～40 0 mg/ L (或 6 0～ 80 mg/ L和 2 0 0～ 6 0 0 mg/ L ) ,在抗性芽继代 (或生根 )培养阶段 ,Kan和Cab分别为 40～ 5 0 mg/ L和 1 0 0～ 2 0 0 mg/ L (或 5～ 1 0 mg/ L和 5 0～ 1 0 0 mg/ L) .Cef(头孢霉素 )对桑树各种外植体的影响效果与 Cab相似 ,但两者的抑菌效果因农杆菌菌株、外植体类型以及培养阶段的不同而存在差异 ,用含 Kan、Rif(利福平 )和 Str(链霉素 )的 LB培养基浸渍叶盘则出现分化率下降、褐化死亡较严重的现象 .     

甘薯毛状根植株再生研究

用发根农杆菌Ｒ１０００菌株感梁甘薯（渝薯３４品种）,获得转化毛状根,从毛状根中选择出了５个无性系,当毛状根培养在含有２ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋１ｍｏｌ／Ｌ玉米素的ＭＳ培养基上诱导出了愈伤组织,当愈伤组织培养在含有１ｍｇ／ＬＫＴ＋１ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＡＡ的培养基上,３周以后获得了再生植株,用随机及增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分子标记检测出了再生植株的多态笥。     

农杆菌介导转化豆科牧草百脉根影响因子

对农杆菌介导转化豆科牧草百脉根的相关影响因子进行了实验研究,结果表明:在百脉根农杆菌转化体系中,以农杆菌AGL1菌株、子叶转化受体、3 d共培养时间以及25 mg/L卡那霉素筛选质量浓度为最佳转化条件.研究还发现,头孢霉素对农杆菌AGL1菌株的抑制作用要强于羧苄霉素.     

Agrobacterium-mediated transformation of herbicide resistance in creeping bentgrass and colonial bentgrass

Embryogenic calli were induced from the seeds of creeping bentgrass ( Agrostis palustris Huds. ) cv. Regent and colonial bentgrass ( Agrostis Tenuis Sibth. F1. Oxen. ) cv. Tiger. The embryogenic calli were precultured on fresh medium for 4-7 days and then co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens, LBA4404,which contains plasmid vector-pSBGM harboring bar coding region, synthetic green fluorescent protein (sGFP) coding region and matrix attachment region (MAR) . After 3 days of co-cultivation, the calli were washed thoroughly and transferred to MS medium containing 2 mg/L of 2, 4-D, 12-15 mg/L phosphinothricin (PPT) and 250 mg/L of cefotaxime. After 2-3 months of selection, the actively growing calli of ‘Regent‘ and ‘Ti-ger‘ were transferred to MS medium with 12-15 mg/L PPT and 250 mg/L cefotaxime for regeneration. The putative transformants were maintained on MS medium with 3 mg/L PPT for long period but control died within 1 month. After establishing in greenhouse, the transformants also showed strong resistance to 0.4 % of herbi-cide Basta but control plants died within 2 weeks. Under confocal microscope, both young leaves and roots showed significant GFP expression. PCR analysis revealed the presence of a DNA fragment of GFP gene at the expected size (380 bp) in the transformants and its absence in a randomly selected control plant.     

饱和D最优设计法在马铃薯微繁培养基筛选中的应用

采用饱和D最优设计法,研究了5种植物生长调节剂与扦插个数的关系,通过记录青薯2号、6号两种脱毒试管苗生长状况,建立了不同植物生长调节剂、不同接种数对试管苗生长的函数模型。结果表明：试管苗最佳扦插个数：7—9个,2,4-D最佳浓度：1．32—2．514mg／L;6-BA最佳浓度：1．05—1．95mg／L;NAA最佳浓度：0．165—0．335mg／L;KT最佳浓度：0．35-0．65mg／L;CA最佳浓度：3．5～6．5mg／L。     

转抗菌肽B基因水稻(Oryza sativa L.)植株的再生

通过研究除草剂Basta对水稻品种台安 1号愈伤组织生长的影响 ,确定了能抑制愈伤组织生长的最低剂量 ;在此基础上将抗菌肽B基因 (cecropinB)和bar基因导入了台安 1号基因组。除草剂抗性鉴定结果表明 :转基因植株表现出对Basta较强的抗性 .