改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5a)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b( )内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5a感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLySS中进行表达,并进行初步筛选.     

含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建

含有大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ） 编码序列的质粒ｐＲＣ２４／ＢＲＩＰ改造后, 依次与含有水稻碱性几丁质酶基因ＲＣＨ１０ 和水稻酸性几丁质酶基因ＲＡＣ２２ 编码序列的质粒ｐＡＢＣ２ 以及含有苜蓿β１ , ３葡聚糖酶编码序列的质粒ｐＡＡＧ８９ 连接, 得到了中间载体ｐＲＡＳ１０ ．ｐＲＡＳ１０再与根癌农杆菌双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 连接, 得到了适合水稻转化的双元载体ｐＲＡＳ１３００ ． 利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４ 中, 并准备将ｐＲＡＳ１３００ 转入水稻, 以期获得对真菌病有广泛且较强抗性的水稻品种     

Chi-linker-Glu融合基因双价植物表达载体的构建及其相关鉴定

将木霉几丁质酶基因Chi和β-1,3-葡聚糖酶基因Glu通过8个中性氨基酸连接起来,形成Chi-linker-Glu融合基因．其中编码区基因长2376bp,共编码792个氨基酸和一个终止子．将该融合基因克隆到中间载体pAHC25中,然后将整个ubi-chi-linker-glu-nos表达盒插入用ubi-bar-nos表达盒代替CaMV35S-gus-nos的高效植物表达载体pBI121中,构建了双价抗真菌基因的重组质粒pBIb-CG,并通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草．PCR扩增和PCR-Southern分析证明已将Chi-linker-Glu融合基因整合到烟草基因组中．     

利用细菌血红蛋白提高大肠杆菌基因工程菌几丁质酶基因的表达

将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)插入几丁质酶基因表达质粒中,然后转入大肠杆菌(Escherichia coli)内,研究vgb基因的表达对几丁质酶基因表达和产物分泌的影响．结果表明,在不同的通氧条件下,vgb基因的表达产物均能不同程度地促进细胞的生长,而且发酵上清液的几丁质酶活性也有提高;若溶氧浓度越低,则效果越明显,可比对照提高达12．1％．同时,由于vgb在大肠秆菌的表达,还可进一步促进几丁质酶在大肠杆菌中的分泌。     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蜡质基因启动子引导Gt1基因表达载体的构建

谷蛋白含量及分布对水稻营养品质起着至关重要的作用．利用PCR技术从“中花11”水稻基因组成功克隆到谷蛋白Gt1基因,再分别以PCR技术和限制酶酶切从p13W。载体上获得水稻蜡质基因（Waxy）启动子、第一内含子和NOS终止子,并以pCAMBIA1301双元载体为骨架,成功构建了由Waxy启动子引导的水稻Gt1基因表达载体,为今后利用转基因技术改良水稻稻米营养品质奠定了基础．     

扁豆几丁质酶基因的克隆及表达

以扁豆总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增到长度为885 bp的扁豆几丁质酶基因cDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429 kDa.以该基因构建pET-21a-chi表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1 mmol.L-1IPTG,诱导5 h,表达产物的酶活力为36.25 U.mL-1.通过常压Sephadex G-50凝胶过滤色谱,DEAE-650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42 U.mg-1.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因载体构建及石斛兰转化

 细菌性软腐病是石斛兰及其它兰花栽培和生产中的一大危害。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）中含有aiiA基因,该基因转入一些植物可赋予植物表现出软腐病抗性。从Bt菌中克隆出aiiA基因,并装载入植物表达载体pCAMBIA1301,构建出可用于转入石斛兰的pSAN载体;首次利用根癌农杆菌EHA105将pSAN载体转入石斛兰,并获得潮霉素抗性苗。这些抗性苗经GUS组织化学染色和PCR检测证实为转基因苗, 这将为获得具有软腐病抗性的石斛兰品种打下基础。     

银合欢壳多糖酶在转基因Khao Da wk Mali 105籼稻中的表达(英文)

通过含有pCAMBIA1300载体(抗潮霉素基因(hpt)作为选择标记基因)的根癌农杆菌菌株EHA105的介导,将326个银合欢I型碱性壳多糖酶基因(KB3,GenBank登录号为:AAM49597)的氨基酸导入到籼稻Khao Dawk Mali 105(KDML 105)植株中,获得了KDML 105籼稻的愈伤组织。pCAMBIA1300载体包含有CaMV35S启动子、银合欢壳多糖酶基因和NOS终止子。在NB培养基的水稻秧苗中愈伤组织的转化率为94%.在培养温度为28℃,以含有4 mg/l BAP和7 g/l植物凝胶再生培养基的条件下,愈伤组织的再生频率高达80%.为了建立一个KDML 105农杆菌转化方法,考察了各方面的因素。共培养期间,在培养基中添加50μM的乙酰丁香酮对提高瞬时转化率非常重要。4周龄的盾片衍生的愈伤组织是最佳的起始材料。添加40 mg/l潮霉素和400 mg/l头孢霉素的NB培养基是水稻愈伤组织选择性转化的最佳培养基,其转化率达到78%.采用PCR、Northern Blot杂交凝胶、Southern Blot杂交凝胶和GUS分析技术研究了愈伤组织和转基因水稻中的壳多糖酶和gus基因的表达。壳多糖酶和gus基因在水稻的多个部位被检测到,包括愈伤组织、叶、根、茎和秧苗,但是它们在水稻根部的含量较少。抗真菌的水稻壳多糖酶表现出抗串珠镰刀菌的性质。     

几种基于pCAMBIA系列多用途新型植物表达载体的改建及优化

以pCHF3,pCAMBIA1301,pCAMBIA3300和pCAMBIA3301载体为骨架, 构建CaMV 35S和rd29A启动子驱动多克隆位点（MCS： SacⅠ, KpnⅠ, SmaⅠ, BamHⅠ, XbaⅠ, SalⅠ, PstⅠ）的通用型重组植物双元表达载体, 得到两种启动子驱动下MCS与eGFP[KG*8]融合的应用型亚细胞定位双元表达载体, 并建立了对大量候选基因进行高通量筛选和功能验证的通用型表达载体系统.     

白桦BpMYB2基因及其启动子克隆、表达分析

克隆了1条白桦MYB转录因子基因,命名为BpMYB2。实时定量PCR分析表明BpMYB2基因在白桦不同器官和组织内的表达量不同,在直立木木质部中表达量最高,其次是人工弯曲处理2周的对应木、应拉木、花序,在叶和芽中表达量极低; 利用染色体步移技术,获得长度为1 284 bp的启动子序列。启动子进行PLACE分析发现,序列中含有TATA box、ARR1AT、WRKY71OS等元件。构建了由BpMYB2启动子驱动GUS报告基因在植物中的表达载体,命名为BpMYB2-1301,利用农杆菌介导法瞬时转化白桦幼苗,并进行组织化学染色。结果表明:BpMYB2的启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦中表达; GUS瞬时表达信号在茎、叶柄中较强,在叶片中较弱,说明BpMYB2基因与白桦木质部发育相关。     

尖镰胞菌细胞色素P450 55a1基因超表达载体的构建和水稻日本晴遗传转化

要将细胞色素P450 55a1基因克隆到镰刀菌素植物超表达载体pCAMBIA1302中,构建了pCAMBIA1302-cyp55a1-gfp1植物超表达载体,以水稻日本晴为遗传转化的受体对象,通过农杆菌介导侵染方法进行了遗传转化.结果表明：成功构建了细胞色素P450 55a1基因超表达载体,获得了多个细胞色素P450 55a1基因超表达的阳性植株,并以RT-PCR技术分析了阳性植株中细胞色素P450 55a1基因的表达水平.     

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.     

单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2?μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物（细胞）筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物，构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统. 该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300 Ubi FLP bar和含有frt位点的植物双抗（抗除草剂、抗盐耐旱）表达载体pCAMBIA1300 Ubi TsPPase frt als frtm以及pCAMBIA1300 Actin1 AtNHX1 frt als frtm组成.     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

甜味蛋白thaumatin-PDI二价植物表达载体的构建

将thaumatin cDNA和PDI基因的上游分别连上启动子,下游连上终止子,通过基因重组技术,克隆到植物表达载体pCAMBIAl302中,构建成一个同时含有thaumatin基因和PD／基因的新的植物二价表达载体pCAMBIAl302-tha-PDI.经测序,该表达载体中的thaumatin基因与PDI基因的编码阅读框序列完全正确。