SPG3A基因的一个新突变导致重症遗传性痉挛性截瘫

在一个重症、病情进展迅速的西藏遗传性痉挛性截瘫(HSP)家系的SPG3A基因中发现了一个以前未报道的致病性新突变, c.1228G > A (p.G410R). 这一突变发生在进化上高度保守的碱基上, 且在家系中与疾病表型共传递; 但在对照组中阙如. 蛋白质结构预测表明, 该p.G410R的改变发生在atlastin分子中鸟苷酸蛋白结合域与跨膜螺旋区的联结部位, 并且位于一个α 螺旋的起始点. 这一突变很可能破坏了这一跨膜螺旋结构, 并引起该分子内跨膜区整体结构的改变. 研究结果表明, SPG3A基因的突变可引起重症HSP, atlastin分子中鸟苷酸蛋白结合域与跨膜螺旋区间的联结部位可能在决定疾病的严重性上起重要作用. 本研究为SPG3A引起的HSP在表型严重性与atlastin分子结构改变程度之间可能存在的关系提供了证据.     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

小鼠RTN3基因mRNA和蛋白在小鼠中枢神经系统的分布模式

根据与人RTN3基因同源的小鼠EST AA237377设计筛库引物, 克隆得到小鼠RTN3 cDNA, 该cDNA长2814 bp, 含1个714 bp的可读框, 编码1个具237个氨基酸的蛋白. Northern杂交检测该基因在小鼠不同组织中的表达谱, 发现它有3个转录本, 分别为1.8, 2.8和4.2 kb, 其中1.8和2.8 kb的转录本存在于多种组织中, 2.8 kb的转录本在脑中的表达量最高, 4.2 kb的转录本仅在脑中存在. 用成年小鼠脑和脊髓切片进行原位杂交和免疫组织化学反应, 发现该基因在中枢神经系统的非胶质细胞中广泛表达, 且在某些区域表达较高, 如海马、大脑皮层、下丘脑及一些神经核团.     

小鼠RTN3基因mRNA和蛋白在小鼠

根据与人RTN3基因同源的小鼠EST AA237377设计筛库引物, 克隆得到小鼠RTN3 cDNA, 该cDNA长2814 bp, 含1个714 bp的可读框, 编码1个具237个氨基酸的蛋白. Northern杂交检测该基因在小鼠不同组织中的表达谱, 发现它有3个转录本, 分别为1.8, 2.8和4.2 kb, 其中1.8和2.8 kb的转录本存在于多种组织中, 2.8 kb的转录本在脑中的表达量最高, 4.2 kb的转录本仅在脑中存在. 用成年小鼠脑和脊髓切片进行原位杂交和免疫组织化学反应, 发现该基因在中枢神经系统的非胶质细胞中广泛表达, 且在某些区域表达较高, 如海马、大脑皮层、下丘脑及一些神经核团.     

22周孕龄人胎肝表达序列标签数据更新与初步分析

随着国际上转录组数据及本室22周孕龄人胎肝表达序列标签数据的不断增加, 先前该组织表达谱的研究有必要进行更新与完善. 本研究首先将22周孕龄人胎肝每一表达序列标签与自身数据库, UniGene, DoTS, MGC以及Twinscan预测的人类转录组数据库进行比对以归类. 然后, 经过电子拼接和基因鉴定, 对已知基因进行GO (gene ontology)分类, 对未知基因进行Pfam和ScanProsite功能预测. 最后, 对人胎肝、成人肝、骨髓、胸腺及淋巴结这些拥有造血作用或可表明人胎肝特性的5种组织进行了层次聚类分析. 结果表明: (ⅰ) 与5种最新人类转录组数据库比对, 极大地降低了那些属于一个基因但互不交叠的序列被划分到不同簇的可能性, 因此在进行EST归类时, 推荐与互联网上有关最新数据进行比对; (ⅱ) 一些先前未知EST已被鉴定为已知基因, 1379个EST被鉴定为本室独有的全新序列; (ⅲ) 通过GO分类, 对22周孕龄人胎肝有了一个大致了解, 同时获得了6个细胞迁移基因和6个造血相关基因; (ⅳ) 通过基因功能预测获得了277个模体(profile), 其中有5个类型可分布于10个以上基因之中; (ⅴ) 层次聚类表明, 5种组织关系与它们的功能相一致; (ⅵ) 建立了世界上最大的22周孕龄人胎肝表达序列标签数据库. 总之, 22周孕龄人胎肝表达序列标签数据的更新与初步分析将有助于对人胎肝造血机制及细胞迁移机制的了解, 可促进未来对该组织进行全面深入的研究.     

一个水稻卷叶突变体rl_(11(t))的遗传分析和基因定位

水稻叶片形态相关突变体的挖掘是进行水稻功能基因组学研究和株型改良的重要基础.本研究从60Co-γ辐射的籼稻粤丰B后代中鉴定一个卷叶突变体,命名为rl11(t),该突变体表型为株高降低、叶片卷曲变窄、叶脉数目减少且发育异常,同时对生长素的敏感性降低.遗传分析表明,该突变性状受一个隐性单基因控制.利用SSR标记将卷叶基因定位在位于水稻第4染色体上RM6089和RM124之间,在该基因附近区域发展了32对新的STS标记,将Rl11(t)精细定位在BAC克隆AL606645上STS4-25和STS4-26之间,物理距离约为31.6kb,为最终克隆目标基因奠定了基础.     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

大肠杆菌核糖体蛋白质L24基因(rplX)的一个新的点突变

大肠杆菌核糖体蛋白质 L24是核糖体50S 大亚基组装的起始蛋白质之一.L24蛋白质发生突变或缺失对细菌的生长速度和细菌体内50S 亚基的含量都有很大影响.本实验室曾报道在一株 L24突变体 T83(rplX)中,λN 基因的表达受阻,λQ 基因的表达基本正常,同时,λN 基因的 mRNA 合成正常,说明λN 基因表达是在翻译水平上受到了抑制.本文通过DNA 顺序分析确定了该 rplX 突变发生的位置是一个 GGT 密码子突变成了 GAT 密码子,     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因克隆及其原核表达载体构建、表达

通过ＰＣＲ方法克隆出大肠杆菌株Ｈ－３０的胞嘧啶脱氨酶基因，并将其起始密码子ＧＴＧ突变为ＡＴＧ，构建了ＣＤ基因的原核重组表达载体ＰＢＶ２２０－ＣＤ，通过测定胞嘧啶脱氨酶活性筛选出ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０ＣＤ－１１５－氟胸嘧啶对ＣＤ活性克隆有杀灭毒性，ＤＮＡ序列分析显示ＣＤ高表达活性克隆Ｈ－３０－ＣＤ－１１较基因文库中所报道的ＣＤ基因存在１６个位点碱基改变，引起肽链中氨基酸改变的位点有５人。     

一个水稻窄叶突变体的鉴定和基因定位

从粳稻品种“中花11”转基因后代中发现了一个窄叶突变体. 突变体表现为植株矮化、生育期延迟、叶片变窄及内卷和结实率降低等一系列突变表型. 窄叶突变体的剑叶在饱和光下净光合速率显著低于野生型, 在灌浆期剑叶的气孔导度和蒸腾速率也明显低于野生型. 遗传学分析表明, 该窄叶突变体表型受一对隐性核基因控制. 通过对突变体T₁代和T₂后代的分子检测发现, 该突变体表型非T-DNA插入引起. 利用籼粳杂交F₂群体对突变体位点进行了基因定位, 将其定位在第12染色体长臂上SSR标记RM7018和RM3331之间. 与经典的形态标记nal3(cul3)位于相同染色体区段, 故将该突变体暂定名为nal3(t). 随后, 利用已公布的水稻序列和SSR标记, 开发了6对新的STS标记, 进一步将窄叶基因nal3(t)定位在NS10和RH12-8之间, 遗传距离分别为0.58和0.26 cM, 物理距离约136 kb, 为进一步克隆nal3(t)打下了基础.     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

STK11 基因在Peutz-Jeghers综合征家系中的突变分析

黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）是一种常染色体显性遗传性疾病。最近，在19p13.3克隆出了PJS致病基因STK11(丝氨酸苏氨酸激酶)。为了进一步研究中国人PJS患者STK11基因的突变情况，应用变性高效液相色谱（DHPLC）和DNA测序方法，对3个多代PJS和3个散发性PJS家系中15例患者和20例正常成员的STK11基因的9个外显子进行了分析，在6个家系中共发现10个由碱基替代导致的点突变。有7个突变可使基因产物发生改变，包括1个无义突变、5个错义突变和1个移码点突变。分别发生在STK11基因的第37（CAG→TAG），123（CAG→CAT），161(ATT→AGT)，194（GAC→GAG）,245(CTC→TTC)和354位密码子（TTC→TTG）及第4内含子3′末端煎接位点部位（AG→AA）。在3个散发PJS家系中，有1个家系的患者，在第5外显子内存在错义突变，其余2个家系的患者，在内含子1（ 36）和内含子3（-51）均存在点突变。研究还发现，有3个多态位点，分别发生在内含子1（ 36），内含子3（-5）和内含子5（ 27）部位。以上结果表明，在PJS患者中存在较高频率STK11基因点突变，突变位点可分散在整个编码区。两代以上发病的家系突变频率较散发病例突变率高，提示STK11基因的改变与PJS的发病密切相关。     

3-酮硫裂解酶基因phbA的克隆、序列分析及功能检测

用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌中合成聚－β－羟基丁酸酯（ＰＨＢ）的一个关键酶－３－酮硫裂解酶基因ｐｈｂＡ。ＤＮＡ序列分析表明,所克隆的基因与国外报道序列同源性很高,只有１个碱基的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率,构建了带有导肽基因的组成型表达载体,并转化烟草得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明,导肽可以将外源蛋白定位于质体,ｐｈｂＡ基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实,转基     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍. 为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc, 利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位. 初步的连锁分析结果表明, Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁, 其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM. 用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库, 并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320 kb的克隆重叠群. 对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序. 用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库, 锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148 kb)序列. 通过比较TAC和BAC克隆的序列, 在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记. 用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46 kb的区域内. 从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因. 基因预测分析显示, 在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

小鼠BRI3基因的克隆及其诱导细胞死亡的作用

为了阐明TNFα作用的分子机制，用抑制消减杂交（SSH）技术和反转录PCR（RT-PCR),从hTNFα处理过的小鼠脑血管内皮细胞（bEnd．3）总RNA中扩增并克隆BRI3的cDNA，构建了BRI3基因与绿色荧光蛋白（EGFP）基因融合的表达载体pEGFP/I3，转染L929细胞后，发现EGFP／I3融合蛋白位于细胞质里，通过TUNEL法检测或流式细胞仪分析初步表明，该融合蛋白在L929细胞中的表达能够导致细胞死亡，而且这种细胞死亡能被L929细胞中表达的Bcl－2蛋白所抑制，提示BRI3基因的功能可能与TNFα的细胞毒作用有一定的相关性。     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图和物理图精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍.为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc,利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位.初步的连锁分析结果表明,Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁,其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM.用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库,并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320kb的克隆重叠群.对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序.用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库,锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148kb)序列.通过比较TAC和BAC克隆的序列,在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记.用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46kb的区域内.从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因.基因预测分析显示,在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

水稻5460F细菌人工染色体文库的构建和鉴定

温敏核不育水稻在杂交水稻的生产中具有重要的应用价值，前人的研究表明，该不育性状是由隐性单基因控制的，本室首次把该基因定位于水稻的第８染色体，并将命名为ｔｍｓｌ，为了构覆盖ｔｍｓｌ基因区域的精细物理图谱并最终克隆ｔｍｓｌ基因，利用１个改进的载体ＰＥＣＢＡＬ进行了温敏核不育水稻５４６０Ｓ的可育恢复突变体５４６０Ｆ细菌人工染色文库的构建。该文库由１６８９６个克隆构成，克隆片段平均大小为１１９ｋｂ相当于水     

生物信息学应用于植物科学的三个实例

本文以3个实例初步展示了生物信息学在植物科学中的应用.第一例先在EMBL数据库中搜索到了15条棉属不同种的ITS序列,然后对它们作了亲缘树分析.第二例对PIR数据库中一条棉花脂转移蛋白的一级、二级结构作了分析之后,使用RasMol软件对典型的脂转移蛋白进行了三维结构观察.第三例对一条拟南芥EST序列作了Blast比对、ORF查找分析之后,将其翻译为氨基酸序列,然后进行了功能预测和同源蛋白的三维结构显示,最后对该EST序列进行了基因组定位.     

水稻穗顶退化突变体paa1331的鉴定及基因定位

水稻穗部是影响产量的重要农艺性状,其发育健全与否直接决定了水稻产量的高低.过去几十年已经有大量的粒型和穗粒数相关基因被克隆报道,但调控穗顶发育相关基因的克隆与功能的报道较少.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的穗顶退化突变体材料paa1331(panicleapical abortion1331).与野生型相比,该突变体主要表现为穗顶端严重退化(退化率高达53%),株高变矮,分蘖减少,穗粒数降低.台盼蓝染色结果表明,穗顶端退化伴随细胞程序性死亡;激素测定结果证明,突变体穗顶部生长素含量高于野生型.遗传分析表明,该突变性状受隐性单基因控制;通过图位克隆与重测序分析发现,基因LOC_Os04g40720第4外显子的碱基A突变成G,导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸.目前该基因未见报道,暂将该基因定为候选基因.     

水稻苗期低温失绿基因cisc(t)的精细定位及其候选基因的确定

籼稻品种Dular在低温条件下幼苗会表现失绿. 前期遗传研究表明, 这种低温失绿的表型是由一个隐性基因控制的, 该基因初步定位在第9染色体长臂的SSR标记RM257和RM242之间, 将该基因暂命名为cisc(t). 本研究在前期初步定位的基础上, 利用粳稻品种Lemont (低温条件下幼苗表现正常绿色)与Dular杂交, 构建了一个很大的F2群体, 将cisc(t)基因精细定位在一个12 kb的区间内. 该区间只含有一个注释基因, 编码一个三角状五肽重复区(PPR)蛋白. 测序结果表明, Dular在该基因的第60位碱基处缺失了8个碱基, 造成移码突变而失去正常功能. 这与Dular表现白化突变表型相吻合. 而且, 前人研究表明, 许多植物的幼苗失绿突变性状与PPR蛋白有关. 因此, 将该基因确定为cisc(t)的候选基因.