反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

基于内含子和外显子的系统发育分析的比较

在灵长目动物中分离出７个断裂基因的内含子和外显子序列，分别进行系统发育分析，比较结果显示：（１）基于内含子与基于外显子所得到的进化树的拓扑结构基本一致，但由于内含子和外显子序列的突变速率不同，导致进化树的分枝长度不同；（２）在ｈｏｍｉｎｏｉｄｓ中，外显子的替代速率下降，而内含子的替代速率相对稳定；（３）当选用ｃｅｂｕｓ作为参考物种时，基于不同外显子推测出的ｏｒａｎｇｕｔａｎ的分歧时间相差较大，而基     

酵母线粒体细胞色素b基因突变的定位和内含子的功能

酵母线粒体DNA(mt-DNA)的细胞色素b(cob)基因是由6个编码区(外显子)和5个非编码区(间隔顺序或内含子)组成的镶嵌结构。长约6.5kb,但成熟的mRNA只有2.1kb,包括全部6个外显子而无内含子。间隔顺序不仅是真核基因的普遍特点,最近发现,原核基因也有内含子。其功能容易被忽视,因此研究内含子的功能具有普遍意义。许多研究者指出,cob基因的内含子突变,不仅使酵母失去了表达细胞色素b的能力,细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因(OXi 3)也不能转录。这种既影响cob基因,又影响OXi 3     

S7核糖体蛋白基因序列变异及其在低等鲤科鱼类中的系统发育意义

鲤科是世界鱼类中最大的科，有210余属2010种，为研究其系统发育关系需要筛选合适的DNA标记，将S7核糖体蛋白基因用作遗传标记进行鲤科鱼类的系统发育分析，通过PCR方法，扩增了长度为602bp的胭脂鱼以及长度为655～859bp的16种鲤科鱼类的S7基因内含子1序列，序列排列得到925个排列位点，其中信息位点499个，占全部位点的54%，结果表明，鲤科鱼类S7基因内含子1序列具有丰富的信息位点，并且在亲缘关系不同的物种间存在显著的序列差异，基于S7基因内含子1序列的NJ（neighbor-joining）和MP(most-parsimony）分支树经1000次重复抽样试验后，节点的自展支持率普遍高于以细胞色素b及线粒体控制区(d-loop）基因为遗传标记时所得到的分支树，因此，S7基因内含子1作为遗传标记在鲤科系统发育研究中的分辨率是比较高的，它是一个适合鲤科内亚科水平系统发育研究的有用的分子遗传标记，但S7基因内含子1是否适用于鲤形目科间或科以上水平的分子系统学分析，有待进一步研究。     

高等植物基因的内含子

针对高等植物基因的内含子结构和功能的研究现状进行了评述，内含子是真核基因的一个重要组成部分，对其结构和功能的认识随着研究的深入而不断变化（或华），高等植物基因内含子的结构特征既有保守性，又有差异，它的剪辑过程涉及诸多频式元件和反式因子之间的相互作用，如5′剪辑位点、3′剪辑位点以及各种蛋白质因子，高等植物基因内含子的剪辑过程是真核生物表达的一个重要环节，特别是内含子的可为剪能够调节基因的时空表达。另外，高等植物基因内含子序列在基因表达调控中也具有重要作用，如影响基因的表达模式、增强基因的表达水平和启动基因的表达等。     

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶．从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1，OsCOA20和OsCOA26．序列分析表明，OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成，OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子．这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高，达75．43％，并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件．系统进化树分析表明，OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系，OscOA20和OsCOA26则属于另一分支．Northern印迹和组织原位杂交结果显示，3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累，在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达，说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切．     

基因组中双重位点特异性重组体系的建立及应用

应用重组ＤＮＡ技术，将ＦＲＴ－ＦＲＴ和ＬｏｘＰ－ＬｏｘＰ两套重组酶特异的识别位点构建在一个名为Ｃ４ＬＦＹ的载体中，并依次在载体中构建了Ｐ因子、果蝇ｙｅｌｌｏｗ基因的两个外显子和一个内含子、顺式作用元件（启动子和增强子）和侧翼区ＤＮＡ，组成了双重位点特异性重组体系。通过转基因技术将该体系整合到果蝇基因组中，再分别与特异的ＦＬＰ和Ｃｒｅ重组酶相互作用后，成功地在基因组同一位点上完成了ＦＬＰ／ＦＲＴ和Ｃ     

鸡生长激素基因单核苷酸多态与生长及屠体性状的相关性

以鸡生长激素(GH)基因作为控制鸡生长和屠体性状主基因的候选基因, 以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, 通过PCR-RFLP方法对GH基因进行多态性检测. 在该基因内含子3中发现1处碱基突变: G →A, 由内切酶EcoR Ⅴ酶切证实; 在内含子4中发现1处碱基突变: C→T, 由内切酶MspⅠ酶切证实, 并由此对F₂代鸡群个体进行基因型鉴定. 方差分析结果显示, 在内含子3中的碱基突变与腹脂性状显著相关; 内含子4中的碱基突变与腹脂、胸肉屠体性状显著相关, 但两处突变与其他大部分生长和屠体性状相关不显著, 结果表明鸡GH基因可能是控制某些屠体性状的主基因, 或与控制这些性状的主基因紧密连锁.     

BRCAA1基因克隆、染色体定位与特征性分析

本介绍了一个克隆新的乳腺癌相关抗原基因BRCAAl．它定位于lq^42．1-q^43，它的基因组长度为93．857kb，包含18个外显子与17个内含子．它编码的蛋白由1214个氨基酸组成，相对分子质量为136．8kd，包括10个糖基化位点，含有一个Rb结合蛋白1的抗原表位IKPSLGSKK，潜在的抗原表位可能位于580～620，640-700氨基酸位点之间．它可能是Rb结合蛋白1家族的成员，可能具有调节细胞增殖的功能．     

人神经元钾离子通道 α 亚基基因的分子克隆

为克隆新的钾子通道基因并研究其与疾病的关系，将大鼠的神经元钾离子通道α亚基编码区序列在人的EST数据库进行BLAST分析，得到一个与其有87％的一致性的EST，通过重叠群的构建和5′－RACE反应，克隆了人神经元钾离子通道α亚基（homo sapiens neuronal potassium channel alpha subunit,HNKA)基因，该基因仅在成人脑和胎脑中有表达，经与大规模数据库比较后将该基因定位在8q23.1-q23.2位点，选择定位于此区域的痉挛性截瘫为HNKA基因的侯选疾病，利用PCR产物直接测序的方法，对14个痉挛性截瘫家系进行了突变检测分析，但未检测到突变。     

山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β－酪蛋白基因启动区５′端上游调控序列和外显子１，２及内含子１在内的乳腺表达载体，并与人血清白蛋白（ｈＡＬＢ）小基因（含全长ｃＤＮＡ序列及其内含子１）构建成融合基因，鼠尾静脉注射实验表明，该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达，应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵，并将受精卵移植于假孕母鼠，共获得３３只Ｆ０代小鼠，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实，有８只小鼠基因组中整合有ｈＡＬ     

荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复

利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.     

固态肿瘤中的融合基因

造成两个基因部分融合一起形成一个混合基因的突变，在血癌中比较常见，如今却在肺癌中发现了一个新的融合基因。据2007年8月2日的Nature杂志报导，索德（Soda）等发现染色体2P位点上基因的重排突变，激活为酪氨酸激酶编码的基因（ALK）。已知该酶是以加磷酸基到酪氨酸残基上的方式，调控其他蛋白质的活动。因该酶与许多癌症有关，所以阻止ALK激酶的活动，可有效治疗带有这种重排基因的癌症。     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

中国普通人群中HIV-1感染辅助受体和配体基因多态性的分析

实验目的是分析中国人群中HIV－1感染相关的CCR5－△32，C5-m303，CCR2－641I和SDF1－3′A等位基因的突变和多态性特点，研究的人群包括2318例中国普通人群（来自全国各地8个民族），年龄范围在15－80岁之间，他们中没有一例是HIV感染者，从上述人群外周血的PBMC中抽提基因组NDA，然后分别应用PCR和PCR／RFLP等方法做基因分型，用直接DNA测序法进一步证实其准确性，结果发现：（1）我国汉族、维族蒙古族人群中CCR5－△32基因突变频率分别为0．16％，3．48％和1．12％，但在藏族、佤族、瑶族、普米族和彝族人群未检测到CCR5－32△突变基因型，与白种人相比，我国人群中CCR5－△32基因突变频率很低，对具有△32突变家系的调查结果显示该突变可能以孟德尔规律遗传给下一代。（2）在中国人群中，未检测到存在CCFR5－m303突变。93）我国人群的CCR2－641和SDF1－3′A突变频率分别为19．15％－28．79％和19．10％－29．86％，统计学分析表明中国汉族人群上上述等位基因型的分布符合Hardy-=Weinberg平衡，上述结果提示在中国人群中除了维族以外，其他民族人群的CCR5－△32遗传突变频率很低，可能不是抗HIV感染的主,外中国人群却具较高的CCR2－641和SDF1－3′A等位基因突变频率，它们可能与延缓艾滋病发病进程有关，这一结论需要进一步证实。     

EBNA1基因在广东地区人群中的变异特征及与鼻咽癌的相关性

EB病毒与鼻咽癌关系密切，其编码的EBNA1蛋白在EB病毒的感染中有重要作用。EBNA1基因有多种变异亚型（包括P-ala原型、P-thr,V-val,V-leu和V-pro亚型）。本研究通过PCR扩增和测序分析发现，在鼻咽癌高发区广东地区144例健康人外周血中EBNA1基因以混合感染为主，可以检测到P-ala原型和V-thr、V-val变异型，其中V-val是主要的亚型。97.22％（35/36）的鼻咽癌患者外周血中以单一亚型的感染为主，且其中大部分是单一的V-val亚型。外周血中EBNA1基因单一亚型的检出对于鼻咽癌的诊断有一定的意义。在36例鼻咽癌组织中均可检出V-val亚型，其中绝大部分（91.67％）是单一亚型感染。说明V-val是广东地区主要的EBNA1亚型，并且与鼻咽癌有密切的相关性。此外，V-val和V-thr变异型的全长测序发现基因编码区内的多处错义突变，提示EBNA1基因的变异可能导致蛋白功能上的改变。     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色．控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体，紫色种皮对白色种皮呈显性．本研究利用培矮64S（白米）×豫南黑籼糯（紫米）和培矮64S×川黑糯（紫米）两个F2分离群体对P易基因进行了精细定位．首先用SSR标记将P易基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0．79cM的位置．然后，通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记，将P6基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内．在该区段内，TIGR水稻基因组（R．5）标有两个注释基因：一个为与玉米k基因同源的砌，为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子；另一个为与拟南芥刀四同源的bhlh16，也与植物色素代谢有关．根据两者的性质和前人相关研究结果，推测Pb与Ra实为同一个基因．序列分析结果表明，与白米品种培矮64S，9311（籼）和日本晴（粳）相比，豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失．根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa，并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析．结果发现，所有F2白米单株以及所有白米（n=63）和红米（n=23）品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同，而所有紫米品种（n=20）与豫南黑籼糯和川黑糯相同．据此推测，水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起．     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L－谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质，其代谢型丙氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用。为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础，通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法，构建了 覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱，并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装，最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列。序列分析表明：mGluR7基因是长达880kb的超大基因；其基因组GC含量为38％，重复序列含量为37．5％，由11个外显子和10个内含子组成，其中5个内含子长度超过100kb，内含子1长达285kb； 存在2个替换剪接转录本mGluR7α和mGluR7b。通过比较mGluR7基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构，发现它们对应的基因组结构分为3组，组内各成员的基因组结构较为保守，而组间各成员的基因组结构保守性较差，这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的，提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化。在含mGluR7的组内，尽管组内各成员的基因组结构趋于保守，但大部分含子长度变化幅度很大，揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化，这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的。     

胃癌组织mtDNA突变与癌变关系的探讨

为了进一步明确mtDNA突变与胃癌发生、发展的关系，利用变性高效液相色谱（DHPLC）和DNA测序技术，对30例胃癌组织和对应的正常组织mtDNA基因组全序列进行了筛查，研究结果确定胃癌中mtDNA存在高频率的突变，突变频率为66.7%（20/30），其中56.7%（17/30）的突变仅见于癌组织，突变频率较高的基因为ND4，ND5和D-loop，分别为36.7%，26.7%和30%，与组成电子传递链复合体Ⅲ，Ⅳ，V的基因相比，复合体I基因在被检测的癌组织mtDNA中的突变频率最高（43.3%），突变类型以碱基替代为主（85.4%），研究结果提示，复合体I基因，特别是ND4，ND5和ND3基因突变在胃癌的发生，发展中起重要作用。