水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

大豆叶片状态转换过程中跨膜质子动力势的变化

用毫秒延迟发光(ms-DLE)研究大豆叶片在状态转换过程中跨膜质子梯度的变化情况. 用弱远红光诱导大豆叶片向状态Ⅰ转换时, 叶绿素室温荧光F_m/F_o和77K荧光F ₆₈₅/F₇₃₅基本不变, ms-DLE快相强度仅受到轻微促进. 用弱红光诱导叶片向状态Ⅱ转换时, F _m/F_o和F₆₈₅/F₇₃₅均呈先迅速下降再转向稳定的趋势, F_m/F_o下降的速度较F₆₈₅/F₇₃₅快; ms-DLE快相强度则是先迅速上升, 接着逐渐下降, 用去除质子梯度的解耦联剂尼日利亚菌素(nigericin)处理后, 快相强度的上升再下降的变化明显地受到抑制, 而用去除膜电位的缬氨霉素(valinomycin)处理后无显著影响. 这表明向状态Ⅱ转换时, ms-DLE快相强度的迅速上升主要与PSⅡ氧化水时向膜内侧释放的质子数量有关.     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F₆后代自然群体中获得1例白穗突变体, 其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色, 抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色. 用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交, 获得一个F₂分离群体. 初步的遗传分析表明, 该突变属单基因隐性性状. 利用已定位的微卫星标记进行连锁分析, 发现该基因位于水稻第1染色体上. 进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点, 连锁分析显示, 该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间, 分别相距2.3和0.8 cM; 并与微卫星标记SSR17呈共分离. 该基因暂定名为wp(t).     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

纳米Fe-In2O3颗粒膜的巨磁光Faraday效应

研究了射频溅射法制备的纳米“铁磁金属-半导体基体”Fe-In₂O₃颗粒膜的巨磁光Faraday效应. 实验结果表明, 当Fe体积百分比为35%时, 颗粒膜样品的室温Faraday旋转角θ_F数值达到10⁵ (°)/cm数量级. Fe_0.35(In₂O₃)_0.65颗粒膜样品的Faraday旋转角θ_F随温度的变化关系表明, 当温度低于10 K时, θ_F数值随温度的下降而迅速增大, 在温度T = 4.2 K时Faraday旋转角θ_F达到10⁶ (°)/cm. 通过研究颗粒膜低场磁化率χ(T)与温度的关系以及不同温度下的磁滞回线, 证明当温度降低到临界温度T_P = 10 K时, 颗粒膜中发生“铁磁态-类自旋玻璃态”转变. Fe_0.35(In₂O₃)_0.65颗粒膜样品的Faraday旋转角θ_F在温度低于 10 K时的迅速增大, 可能是由于纳米“铁磁金属-半导体基体”Fe_0.35(In₂O₃)_0.65颗粒膜样品在处于“类自旋玻璃态”时存在sp-d交换作用造成的.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.     

热处理过程中磷脂酰胆碱对光系统Ⅱ膜复合物的保护作用

将光系统Ⅱ膜复合物与具有不同脂酰基侧链的磷脂酰胆碱(PC)重组, 然后利用氧电极、可变荧光和圆二色光谱研究在热处理过程中磷脂酰胆碱对光系统Ⅱ膜复合物的保护作用. 热处理降低了光系统Ⅱ膜复合物的放氧速率和F_v'/F_m' , 同时影响了光系统Ⅱ膜复合物的圆二色光谱, 但是PC抑制了热处理对光系统Ⅱ膜复合物的放氧速率、F_v'/F_m' 和圆二色光谱的影响. 这些结果暗示在热处理过程中, PC对光系统Ⅱ膜复合物有保护作用, 并且PC的脂酰基侧链的不饱和程度对PC的热保护能力有影响.     

ENU诱变获得4种白斑小鼠及对突变基因的染色体定位

“表型驱动法”是通过诱变、定位及克隆突变基因来研究基因功能的一种手段. 以ENU处理C57BL/6J(B6)雄鼠150只, 繁殖后代小鼠3860只, 筛查到有突变表型的小鼠210只, 经传代实验得到能够遗传的突变鼠10余种, 其中4种为呈显性遗传的白斑突变, 它们是Wbct, W^−1Bao, W^−2Bao和W^−3Bao, 共同表现为腹部、四肢末端及尾部的局部白化. 为定位这些突变基因, 选择平均分布于小鼠基因组且在B6与DBA/2J(D2)间有差异的微卫星标记39个, 区分(B6×D2)×D2的F₂代有无白斑表型后, 用39个微卫星进行基因组扫描. 结果表明, W^−1Bao突变基因与D5Mit168的LOD值为0.56, 与D5Mit352的LOD值为4.47. 在此基础上, 逐步选择接近突变基因的微卫星D5Mit290, D5Mit312, D5Mit356及D5Mit308, 扩大F₂的数量至537只, 将W^−1Bao突变基因定位在第5号染色体D5Mit356及D5Mit308之间, 距着丝粒约42.19 cM; 同理, 将W^−2Bao及W^−3Bao突变基因也定位在与W^−1Bao相近的区域, Wbct突变基因定位于第1号染色体距着丝粒约41.6 cM处. 经过检索小鼠基因组数据库和对染色体局部基因的逐个分析, 认为kit基因为W^−1Bao, W^−2Bao及W^−3Bao白斑突变的候选基因.     

肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性

通过定点突变及基因替代技术, 将肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)野生型菌株的固氮酶钼铁蛋白α亚基中铁钼辅因子(FeMoco)周围多肽链的Glnα190和Hisα194分别置换为Lys和Gln, 并构建成2个单突变株,命名为Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q. 将上述2个突变分别引入Kp-nifV突变株(与FeMoco相连接的高柠檬酸被柠檬酸置换)获得另外2个双突变株, 命名为Kp-Qα190K-nifV^−和Kp-Hα194Q-nifV^−. 对上述4种突变株进行诱导培养和细胞的固氮酶活性分析表明, 4种突变株都失去了固氮活性, 乙炔(C₂H₂)还原活性也大幅度降低, Kp-Qα190K单突变株的乙炔还原活性比Kp-Hα194Q单突变株下降得多; Kp-Qα190K-nifV^−双突变株几乎完全丧失了活性, 而Kp-Hα194Q-nifV^−野生型菌株10%的乙炔还原活性. 突变株将氘代乙炔(C₂D₂)还原成氘代乙烯(C₂D₂H₂)的情况是: Kp-Qα190K和Kp-Hα194Q-nifV^−突变株的C₂D₂还原产物中, 反式-1,2-二氘代乙烯比例比Kp野生型增加了1倍, 表明固氮酶催化加氢的立体构型选择性降低. 以上结果表明, 固氮酶活性中心周围多肽环境中Glna190残基, 及与FeMoco相连的高柠檬酸, 可能直接参与质子和/或电子向活性中心FeMoco的传递. 推测Glna190和与FeMoco的Mo原子相连的高柠檬酸, 在质子和/或电子通过Mo位进入FeMoco起关键作用. 这种双突变株所产生的固氮酶, 有利于在体外研究固氮酶的催化机制, 可以通过分析用于还原底物的电子和质子进入活性中心FeMoco的位点, 推测出底物在活性中心中的络合和还原的部位.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其K_m = 0.275, V_max = 0.014 mmol·L^-1·min^-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

粉尘螨过敏原在转基因植物中的致敏活性分析

在转基因食品潜在致敏性的研究中, 将粉尘螨过敏原基因(Derf₂)引入植物中表达. 经PCR, Southern和Northern杂交以及ELISA检测证明, 外源基因已发生整合并正常表达, 表明转基因烟草作为一个实验系统来研究基因产物的致敏性是可行的. 同时, 采用RT-PCR从转基因烟草中扩增出经植物加工后的致敏原基因Derf₂片段, 序列比对证明植物(烟草)能对动物(粉尘螨)的内含子进行正确识别和有效剪切.     

光驱动FoF1-ATP合酶复合物顺时针旋转的观察

将含有10个组氨酸的嗜热菌F₁β亚基通过杂交引入光合细菌载色体(Chromatophores)复合物的F_oF₁-ATP合酶中. 对该杂交复合物的生化性质研究表明, 其具有较好的质子转运能力, 杂交的F_oF₁-ATP合酶能够有效地催化载色体的光合磷酸化, 其F₁β亚基的10个组氨酸可与Maleimido-C₃-NTA连接后再与FITC标记的肌动蛋白微丝连接. 光照后在荧光显微镜下观察到, 与该杂交复合物b亚基连接的荧光微丝顺时针方向旋转, 即质子动力势(pmf)引起的F_oF₁-ATP合酶F₁β亚基(或α₃β₃六聚体)上荧光微丝的顺时针方向旋转. 初步建立了F_oF₁-ATP合酶在pmf推动下F₁β亚基(或α₃β₃六聚体)旋转的研究体系.     

一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位

对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作. 本研究在粳稻中花11中鉴别了一个新的卷叶突变体, 并对其进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该卷叶突变体是由一隐性单位点(rl_9(t))控制, 利用SSR标记已经把Rl_9(t)定位在水稻第9染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在Rl_9(t)附近区域发展了30个新的STS标记, 对Rl_9(t)进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖Rl_9(t)区域的PAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约42 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为

将玉米的转座子系统Ac/Ds导入水稻基因组中诱导产生突变体的方法已成为构建水稻插入突变体库的主要策略之一. 本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交, 构建水稻的Ac/Ds双因子转座系统, 对F₁~F₅代的Ds转座行为进行了研究. 通过转座检测, 发现1例Ds转座引起约170 bp T-DNA载体序列的缺失, 另1例Ds转座插入基因组时带有一段272 bp的T-DNA载体序列. 对F₁~F₅代Ds转座的连续检测结果表明, 配子体转座频率随世代的增加而提高, F3代的配子体转座频率达54.2%. 采用TAIL-PCR的方法扩增Ds元件旁侧的基因组序列, 对17个TAIL-PCR产物的序列进行了分析, 发现有5例Ds插入到基因序列中, Ds既可发生邻近位置的转座, 也可发生不连锁的转座, Ds在染色体间的转座频率为33.3%.     

拟南芥中AtMEK5激活导致不依赖于水杨酸信号途径的细胞死亡

用MBP作为磷酸化底物的凝胶内激酶活性分析结果显示，在转基因拟南芥植株中诱导表达组成型激活的AtMEK₅蛋白（AtMEK₅^DD）引起的细胞死亡和用带有avr Rpt2基因的病原菌P. Syringe处理转基因植株导致的超敏性细胞死亡过程中，44kDa和48kDa的两个MAPK均被激活；AtMEK₅^DD在NahG转基因烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥杂交植株AtMEK₅^DD x NahG中诱导表达依然引起细胞死亡，且杂交植株中AtMEK₅^DD表达并未引起水杨酸含量的显著变化； Northern检测结果显示，病原菌处理可显著诱导AtMEK₅^DD转基因植株中PAL、PR1和PR5 基因的大量转录，而AtMEK₅^DD的表达仅导致PR5 基因的大量转录；表明有别于超敏性细胞死亡的水杨酸依赖特性，AtMEK₅激活引起的细胞死亡不依赖于水杨酸信号途径。     

以树轮晚材宽度重建公元1726年以来贺兰山北部5~7月降水量

通过分析早材宽度(EWW)、晚材宽度(LWW)、整轮宽度(TRW)、最小密度(D_min)和最大密度(D_max)共计5个树轮标准年表的统计特征及其各自气候响应, 最终以晚材宽度对贺兰山北部公元1726年以来5~7月的降水进行了重建, 方差解释量42%(R²_adj=0.41, F = 31.46, P < 0.000001). 11年滑动平均后, 方差解释量达82%(F=156.9, P<0.05). 重建降水序列在10年际尺度上与内蒙古东部白音敖包地区4~7月上旬降水具有相当好的一致性, 在一定程度上反映了东亚夏季风锋面强弱的变化. 谱分析检测出贺兰山北部5~7月降水序列主要存在11和22年的波动周期.