羊种布鲁氏菌M5—90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5—90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS—T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆人大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS—PAGE,而后Western—blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP3I基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99．03％;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western—blot检测到。结论：表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。     

应用噬菌体随机肽库研究抗溶藻弧菌及其外膜蛋白单抗识别的特异性表位

用噬菌体随机七肽库筛选制备的抗溶藻弧菌及其外膜蛋白的纯化单抗，经3轮淘洗，获得较高程度富集的噬菌体，效价较高，第3轮淘洗比第1轮淘洗的产量高出近百倍。同时获得的阳性噬菌体经ELISA检测能与Va抗原发生强的阳性反应，确证了淘洗筛选的结果。     

sFcγRⅡb蛋白结合肽的筛选与鉴定

FcγRⅡb是免疫球蛋白G受体( FcγR)中唯一的抑制型受体,在免疫反应的负性调节方面发挥重要作用.为了筛选sFcγRⅡb的蛋白结合肽,以重组sFcγRⅡb蛋白为靶分子,采用噬菌体肽库展示技术对sFcγRⅡb结合肽进行筛选.利用ELISA鉴定每轮洗脱噬菌体与sFcγRⅡb蛋白亲和力,经过4轮筛选,挑取40个噬菌体克隆进行序列测定,获得28种不同的12肽序列.经ELISA法鉴定噬菌体与sFcγRⅡb蛋白结合活性,得到sFcγRⅡb蛋白高特异性、高亲和力结合肽FHKMPWYMSMYY,为进一步研究FcγRⅡb的作用机制和探索结合肽的功能提供实验基础.     

异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的优化筛选

利用噬菌体肽库筛选与计算机模拟分子对接技术, 优化异柠檬酸裂解酶肽类抑制剂的筛选. 先通过噬菌体肽库筛选出与异柠檬酸裂解酶（ICL）具有高亲和力的结合肽, 再利用Discovery Studio 2.1模拟多肽与ICL蛋白晶体（1F8I）的分子对接, 最后用Fmoc固相合成法合成多肽, 并对其生物活性进行检测. 实验结果表明, 通过噬菌体肽库筛选得到了29条七肽序列, 其中12条可与ICL蛋白晶体成功对接. 体外生物活性检测结果显示, 得到的12条七肽均对ICL的活性有明显抑制作用（抑制率均超过50%）.     

骨髓间充质干细胞亲和肽的筛选

采用噬菌体肽库技术，用分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞筛选噬菌体环七肽库，通过酶联免疫吸附实验挑选出亲和性强的克隆.测序分析相应的基因组成，推导多肽序列，获得骨髓间充质干细胞高亲和性多肽，并合成FITC标记的亲和肽（FITC-CSTNPKVLC），流式细胞仪检测结果显示，合成多肽对筛选细胞具有良好的亲和力．     

HPV-58型E7蛋白抗原模拟表位的筛选及分析

利用该实验室成熟的噬菌体随机十二肽库筛选平台,对HPV-58型E7蛋白单克隆抗体株4C4a、6C7a进行3轮亲和筛选,得到2组、各8个阳性噬菌体克隆.阳性噬菌体氨基酸序列用以模拟单抗(靶蛋白)特异性识别的HPV-58型E7蛋白的抗原表位.将测得的阳性噬菌体多肽序列及HPV-58型E7蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析后,进行线性序列比对及构象性表位预测及分析.构象性表位的预测借力于EpiSearch Server和Pepitope Server,对构象性表位匹配及簇的寻找提供有力支持,也为早期诊断及研制多肽疫苗提供参考.     

HPV 58型E7蛋白特异结合多肽的筛选及分析

 利用M13噬菌体展示技术筛选HPV 58型E7蛋白特异性结合12肽,对这些多肽的序列比对分析得出其共有序列,同时通过BLASTP序列对比分析获得能与E7结合的内源蛋白.利用GST-E7融合表达蛋白为正筛靶分子,GST蛋白为负筛靶分子进行4轮的正负亲和筛选,经过ELISA活性鉴定获得71株阳性克隆,通过DNA测序和序列分析,得到2个能与E7蛋白发生特异性结合的共有序列NHXXANPQQXPQ和TMGFTAPRF-PHY.通过BLASTP分析所有71个多肽在体内的同源蛋白,它们能为对E7蛋白的致癌机理研究提供方向.     

胃癌细胞及临床标本特异结合的多肽的筛选与鉴定

从噬菌体随机十二肽库筛选出两个与人胃腺癌细胞SGC-7901表面特异结合的阳性噬菌体克隆,用细胞免疫荧光法鉴定这些克隆与SGC-7901结合的特异性,据亲和力确定克隆GSP5为最佳克隆,进一步以免疫细胞/组织化学等方法鉴定此克隆与胃癌细胞和临床组织的特异性/敏感性.结果显示,噬菌体克隆GSP5对SGC-7901细胞及胃癌临床组织具有较好的结合特异性/敏感性.该多肽有望成为胃癌分子影像诊断与靶向治疗的候选多肽导向分子.     

从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质配基

为了研究噬菌体展示技术的应用，以溶菌酶为靶分子从七肽噬菌体展示库中筛选蛋白质的高亲和力噬菌体配体，所筛选的亲和力最高的噬菌体的ELISA检测值A405nm可达0．634．通过比较亲和性噬菌体外源插入肽的DNA序列，认为基元HWWW是肽段与酶分子发生亲和的必需序列．此外，由于靶分子和高亲和性展示肽的等电点分别为11．2和6．74，因此在亲和环境中携带异种电荷，利于亲和吸附的发生，而此时低亲和性展示肽与靶分子携带同种电荷，阻碍了亲和吸附．同时，高亲和性肽段HWWPAS和与其有较高同源性的肽段HWTWWNL都有适中的疏水性，这有利于肽与靶分子表面的疏水位点相互作用从而产生亲和吸附．     

Cε3-Cε4结合肽筛选及鉴定

为了获得免疫球蛋白E(IgE)特异性结合肽,采用固相筛选法,以Cε3-Cε4为靶蛋白,利用噬菌体随机多肽展示技术进行筛选,4轮筛选后,经ELISA鉴定获得19个阳性单克隆噬菌体,阳性率达38％,测序并翻译后共获得11个结合肽.竞争抑制性实验证明P7,P13,P20与Cε3-Cε4蛋白的结合能力较强,细胞水平分析表明:结合肽P7,P20可阻止IgE与其受体结合.本研究将为进一步探索IgE结合肽生物学功能奠定基础,并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供参考.     

在肽库中筛选β2糖蛋白Ⅰ的小肽配体

以β2GPⅠ为目标分子, 在噬菌体表面展示肽库中进行亲和性筛选, 经过4轮筛选后, 噬菌体的收率从2.4×10-5%提高到1.1×10-3%. 随机挑取噬菌体克隆, 测定其与β2GPⅠ的结合活性, 选取其中结合力较强的克隆进行DNA序列测定, 得到一组保守序列(YFSAF), 经与人凝血酶受体前体序列(271～278)比较, 发现它们具有明显的相似性. 经竞争性ELISA分析实验, 含有该序列的噬菌体克隆能够抑制β2GPⅠ与抗磷脂抗体的结合, 抑制率可达20%左右.     

噬菌体筛选技术筛选与联萘酚(BINOL)相结合的抗体

利用噬菌体展示技术筛选只结合1种对应体的BINOL抗体,建立人类单链抗体(scFv)噬菌体文库--Griffin.1文库,以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.从经过4轮富集的次级抗体库中挑选到噬菌体克隆,用该克隆制备的单链抗体阳性克隆,经ELISA证实具有良好的抗原特异性.从人类scFv噬菌体文库中获得抗BINOL的特异性抗体.     

在肽库中筛选β_2糖蛋白I的小肽配体

以β2 GP 为目标分子 ,在噬菌体表面展示肽库中进行亲和性筛选 ,经过 4轮筛选后 ,噬菌体的收率从 2 .4× 10 -5 %提高到 1.1× 10 -3 % .随机挑取噬菌体克隆 ,测定其与 β2 GP 的结合活性 ,选取其中结合力较强的克隆进行 DNA序列测定 ,得到一组保守序列( YFSAF) ,经与人凝血酶受体前体序列 ( 2 71～ 2 78)比较 ,发现它们具有明显的相似性 .经竞争性 ELISA分析实验 ,含有该序列的噬菌体克隆能够抑制β2 GP 与抗磷脂抗体的结合 ,抑制率可达 2 0 %左右     

利用十二肽库筛选心肌型脂肪酸结合蛋白特异性的亲和配体

采用噬菌体表面展示十二肽库对心肌型脂肪酸结合蛋白（H FABP）特异性亲和配体进行筛选, 经3轮筛选及序列比对后得到一个酶联免疫测定分析 (ELISA)检测阳性特征序列： W P N H H M L H K R W P. 对此序列进行肽合成, 并标记上荧光标记物芘, 经高效液相纯化、 冻干及质谱确定其分子量后制成荧光肽探针检测急性心肌梗塞病人血样, 结果均呈阳性. 结果表明, 所获得的肽探针具有较好的临床应用效果.心肌型脂肪酸结合蛋白; 噬菌体表面展示十二肽库; 亲和配体; 酶联免疫测定分析     

利用噬菌体肽库筛选小肽免疫抑制剂

利用MT-2细胞系特异性表达白细胞介素2受体α(IL-2R α)在细胞表面,作为靶蛋白在噬菌体六肽库中筛选,经过4轮筛选得到能特异性结合IL-2R α的配体,挑选出与IL-2R α亲和性高的21个噬菌体克隆,经过DNA测序,得到3组肽序列,其中2组序列分别与白细胞介素2(IL-2)的N端17-24(LLLDLQMI)序列和C端114-121(IVEFLNRW)序列相似,另外一组与IL-2R β和γ有共同的保守序列(WSXWS)相似.因此推测这些筛选到的序列可能模拟IL-2与受体α相互作用的位点和IL-2R β,γ与α结合的位点.根据筛选结果,进一步合成了一个九肽AIVEFLNRW,以ConA诱导的淋巴细胞转化实验为模型,观察到这个肽在终浓度≥31.3μg/mL时抑制效果明显.     

人卵巢癌细胞靶向多肽的筛选与初步鉴定

采用改良的生物淘筛(Biopanning)流程,以人卵巢癌细胞为靶细胞进行5轮消减筛选,从噬菌体展示12肽文库(Ph.D-12phage displayed peptide library)筛选到靶向人卵巢癌的12肽克隆,通过ELISA、细胞免疫荧光法等方法从细胞水平鉴定了最佳阳性多肽噬菌体克隆R20靶向卵巢癌细胞的特异性和敏感性。结果显示:R20可以特异的、敏感的与卵巢癌细胞SKOV3结合,不与正常细胞或者其他癌细胞结合,具备进一步研发为卵巢癌导向分子元件而应用于卵巢癌靶向诊治试剂或药物研发的潜力。     

利用噬菌体展示筛选结合水稻条叶枯病毒S蛋白的短肽

利用噬菌体展示技术在随机7肽库中筛选到结合水稻条叶枯病毒（rice stripe virus ,RSV）病害特异蛋白（stripe disease-specific protein,S蛋白）的6个短肽,并进行了序列测定,ELISA结果表明,6个短肽和S蛋白具有一定的亲和能力,筛选到的短肽对今后S蛋白功能分析、转基因抗RSV和水稻条叶枯病的诊断提供了条件。     

ICAM-1特异结合肽的淘选与性质研究

利用噬菌体展示载体pCANTAB5G8构建了随机十五肽库,根据转化率计算库容量为1.36×108.用PCR-SSCP检验了库的异质性.以固相包被亲和淘选的方法,经过4轮淘选和ELISA分析,得到了5个可与重组人细胞间粘附分子1(ICAM-1)特异结合的噬菌体克隆,对所展示的十五肽进行了序列分析.其中活性较高的噬菌体展示十五肽与ICAM-1的亲和常数约为7.87 ×107.     

布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立

为了表达并纯化布鲁氏菌BP26蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。方法：从布鲁氏菌疫苗株M5—90克隆bp26基因,在大肠杆菌E．coli B121（DE3）中表达,纯化BP26蛋白,进行SDS．PAGE、Western—blot检测,将纯化的BP26蛋白包被ELISA板,建立检测布鲁氏菌病的间接ELISA方法,用该方法检测42份绵羊血清,结果与标准试管凝集试验（SAT）进行比较。结果显示：正确表达并纯化了BP26蛋白,布鲁氏菌标准试管凝集试验检测的阳性率为30．85％（13／42）;间接ELISA方法检测的阳性率为35．71％（15／42）,二者阳性符合率为86．67％（13／15）。结论表达、纯化的BP26蛋白能够与布鲁氏菌阳性血清特异性结合,建立的ELISA方法比SAT方法更敏感。为以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的应用提供配套性血清学检测奠定基础。     

小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合多肽的筛选

胚胎干细胞是从哺乳动物胚胎发育早期的囊胚的内细胞团内分离出来的一类细胞,具有自我更新和全能性的基本特征.作者利用M13噬菌体展示技术筛选与未分化的小鼠胚胎干细胞R1表面特异结合的多肽.实验利用未分化的小鼠胚胎干细胞为筛选靶细胞,分化的小鼠胚胎干细胞为吸附细胞,进行3轮的消减筛选,经细胞ELISA鉴定,噬菌体DNA测序和多肽序列分析,得到13条能与小鼠胚胎干细胞特异结合的多肽.通过BLASTP比对发现有11个体内的同源蛋白,为进一步研究小鼠胚胎干细胞表面分子提供研究基础.