大熊猫核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的cDNA克隆及序列分析

为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps26基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基基因rps26的异同,以大熊猫的肌肉组织为材料,根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,成功地克隆了核糖体蛋白亚基基因rps26的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫rps26亚基基因的表达序列长为413 bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为13.025 2×103,等电点为11.61.拓扑预测显示该蛋白含有3个功能位点:1个N-糖基化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ蛄姿峄?位点和1个核糖体蛋白S26e signature位点.进一步分析发现,大熊猫rps26基因与已报道的人、西藏黄牛、野猪、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为90.23%、91.67%、92.82%、87.36%和86.78%;氨基酸序列同源性均为99.86%.     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT—PCR技术,首次从大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS 24（Ribosomal Protein S24）基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析．结果表明：大熊猫RPS24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框（ORF）为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15．3251kD,pI为10．92,含有7种类型共14个功能位点：即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e signature．进一步分析发现,大熊猫RP524基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性：编码序列同源性分别为94．1％、92．4％、94．7％、89．9％和90．4％;与人RPS24蛋白的氨基酸序列同源性为98．48％,其余均为99．24％．     

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶（Cytochrome C Oxidase）亚基Ⅲ基因（mtCOXⅢ）的相关信息设计引物，运用PCR技术，首次从亚洲黑熊四川亚种（以下简称四川黑熊，Ursus thibetanus mupinensis）的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列，并对其进行了初步分析.结果表明：四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp，ORF是783 bp，编码261个氨基酸的蛋白质，该蛋白的等电点为6.47，分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现，四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.     

血吸虫膜相关抗原基因的克隆

目的:筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,S.japonicum)新的疫苗候选抗原基因.方法:以S.japonicum成虫DNA为模板,PCR扩增相关基因,然后将其克隆XpBS-T载体,通过菌落PCR对产物进行检测,对阳性克隆子测序,与GeneBank中的已知相关序列进行比对分析.结果:菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明PCR产物与S.japonicum 22.6 kDa抗原分子核苷酸序列具有高度同源性.其目的基因大小636 bp,具有一个189 bp的ORF,能编码63个氨基酸.ORF不是全长的阅读框,只获得部分编码区.表达产物可含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).讨论:成功克隆出一个与S.japonicum 22.6kDa抗原编码基因有高度同源性的基因.预测该基因为膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体表膜相关蛋白.在生理机能上,该膜相关蛋白可能是信号传递分子.     

家蚕浓核病毒BmDNV-1(伊那株)结构蛋白基因VP4的克隆、表达及抗体制备

为研发新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)疫苗候选抗原基因,为血吸虫诊断和疫苗研制提供依据,提取和纯化S.japonicum成虫DNA,PCR扩增相关基因,然后将其克隆入pBST载体,对菌落PCR阳性克隆子测序和分析.菌落PCR获得一条与PCR产物一致的DNA片段,PCR产物与S.japonicum 22 600抗原分子DNA序列具有高度同源性,636 bp大小,oRF189 bp,ORF小是全长的蒯读框,只获得部分编码区,能编码63个氨基酸,表达产物含有一个包含9个氨基酸残基的潜在螺旋跨膜片段(25～33位)和一个酪氨酸激酶磷酸化位点(38～39位).本研究所获取的阳性克隆是与S.japonicum 22 600抗原编码基因有高度同源性的基因.通过Blastn和BLASTP分析,预测该基因为体膜相关蛋白基因,可编码血吸虫体壁相关蛋白,可能是信号传递分子.     

嗜热真菌Thermomyces langinosus编码丝/苏氨酸蛋白激酶部分cDNA的克隆及序列分析

根据几种丝状真菌保守的氨基酸序列,设计了一组简并性的引物,从嗜热真菌Thermomyceslanginosus中提取总RNA,利用RT-PCR的方法,我们得到了一个1243bp的cDNA的片段。片段回收纯化后连接到pGEM-Teasy载体上,PCR扩增重组质粒证实这个长约1200bp片段已经插到载体上。序列分析发现和裂殖酵母的蛋白激酶dis1非常相似,比较两者3'氨基酸序列发现同源性达28%以上。其推断的氨基酸序列上包含有6个丝/苏氨酸蛋白激酶的保守亚区。这些都表明它编码的基因可能是一个新的丝/苏氨酸蛋白激酶。     

生物信息学技术克隆并分析新基因STRF7

为进一步研究信号转导相关的新基因片段BE644250,采用生物信息学方法克隆基全长cDNA,并分析了其ORF,电子表达谱,染色体定位等,之后对全长序列进行了实验验证。电子延伸（contig)获得了729bp的延伸产物,含一个典型的74aa的ORF,命名为STRF7。与已知蛋白无明显同源性,部分地相似于人的源框蛋白CDX－4和酵母的转录调节子ADR6,属一新发现的基因;RT－PCR从IL－6刺激后的U937中克隆了STRF7基因,基序列与电子延伸结果安全一致,进一步的分析显示STRF7在多种组织中表达并定位于第6号染色体上,上述结果显示,STRF7是一个新基因,编码含74aa的蛋白,并且是一个潜在的转录因子。     

拟穴青蟹β-肌动蛋白基因的克隆与分析

β-肌动蛋白广泛存在于真核生物中,在维持细胞结构、细胞运动和细胞分裂等生理活动中发挥着重要作用.运用RACE技术克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)β-肌动蛋白基因,并用RT-PCR方法检测该基因在成体各组织中的表达情况.拟穴青蟹β-肌动蛋白cDNA全长1 337 bp,5′端非编码区为67 bp,3′端非编码区为139 bp,开放阅读框1 131 bp编码376个氨基酸.拟穴青蟹β-肌动蛋白与其他节肢动物β-肌动蛋白氨基酸序列的相似性高达98％～99％.系统进化树显示拟穴青蟹β-肌动蛋白基因的分子进化地位与其生物学分类地位一致.半定量RT-PCR分析结果表明,β-肌动蛋白基因在拟穴青蟹视神经节、脑神经节、胸神经节、性腺、鳃、心、胃、肌肉、肝胰腺共9个组织器官中的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

元江普通野生稻金属硫蛋白基因的获得和序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库进行随机测序,获得了元江普通野生稻的金属硫蛋白基因cDNA序列.该序列全长525 bp,开放阅读框长186 bp,编码62个氨基酸,10个半胱氨酸集中分布在肽链的N端和C端,该蛋白的分子量为6.42 kD,理论等电点为5.21.氨基酸序列(Blastp)同源性分析表明该基因属于金属硫蛋白家族.     

鸡新城疫病毒ND-xx08株F基因的克隆及分析

新城疫病毒（NDV）ND-xx08毒株经10 d龄SPF鸡胚增殖后,提取其基因组RNA并反转录成cDNA,用NDV F基因特异性引物,经PCR扩增后获得与F基因预期大小一致的DNA片段。将NDV F基因片段克隆到pMD18-T载体上,并进行EcoR I和Hind III双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示,ND-xx08毒株F基因片段的长度为1 662 bp,共编码554个氨基酸,F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,是典型强毒株氨基酸序列结构。将NDV ND-xx08株F基因的47 bp到420 bp序列与新城疫病毒基因型I至基因型Ⅸ毒株的相同序列绘制病毒基因进化树,显示ND-xx08分离株属于基因Ⅶe型。将NDV ND-xx08株F全基因与国内外发表的23株NDV F基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较分析,结果表明,其核苷酸序列的同源性在82.7%~97.8%之间,氨基酸同源性在87.5%~97.7%之间。     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及序列特征分析

采用cDNA 末端快速扩增( rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫（Euplotes vannus）GPx cDNA特征进行分析. 克隆到扇形游仆虫GPx cDNA全长序列为672bp,该序列编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,且具有一定的保守性,含有3个催化残基和3个特征性基序．氨基酸序列进化分析结果表明,扇形游仆虫与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近,研究结果为扇形游仆虫GPx在生态毒理学的应用提供基础信息．     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.