电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

人凝血因子ⅨcDNA离体表达调控的研究

构建了带有人ｈＦⅨ ｃＤＮＡ及不同调控顺序的重组质粒和反转录病毒载体，系统比较了不同启动子，增强子在不同靶细胞中对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的作用，ＭｏＭＬＶ病毒的ＬＴＲ启动子在小鼠成纤维细胞中控制转录能力较强，还研究了ｈＦⅨ基因自身内含子Ⅰ及ＩＬ－２基因内含子对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ的表达增强艇，并就双启子和选择基因对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的影响进行了实验探讨。     

形成多角体家蚕重组病毒通用转移载体构建

从家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）通用转称载体ｐＢＫ２８３和粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）转移载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列出发，构建了一个７．２ｋｂ能形成多角体且可以用于克隆含不同读码框外源基因的ＢｍＮＰＶ通用转移载体系列ｐＢＭＸ３．ｐＢＭＸ３系列以ＢｍＮＰＶ多角体结构基因上游的１．９ｋｂ和下游１．３ｋｂ的片段作为与ＢｍＮＰＶ基因组进行体内同源重组的同源序列；ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３系列的ＳＸＩＶ双启动子用于外源基因的表达；ＡｃＮＰＶ的多角体基因作为重组病毒形成多角体的基因．以ＢｍＮＰＶ－ＬａｃＺ（ｏｃｃ－ｇａｌ＋）为出发株病毒，ｐＢＭＸ３系列的重组病毒筛选有ｏｃｃ＋和ｇａｌ－两个遗传标记     

腺病毒同源重组子的鉴定

携带入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列的Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉淀法共转染２９３细胞，经同源重组，共获得６个病毒噬斑。病毒噬斑感染２９３细胞，至出现完全细胞病变效应（ＣＰＥ）后，抽提细胞内的病毒ＤＮＡ，经ＸｈｏⅠ酶切后走凝胶电泳，出现重组腺病毒圾的３．５ｋｂ大小的ＤＮＡ条带，＾３２Ｐ标记的探针ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ＸｈｏⅠ酶切过的病     

启动子对外源基因在转基因植物中表达的影响

将来自ｐＢＩ１２１质粒的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子片段插入到ｐＢＩ１２１的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与ＧＵＳ基因之间，构建了串联的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子载体ｐＬＢ３８．通过三亲交配，将ｐＢＩ１２１及ｐＬＢ３８分别转移到含ｐＧｖ３８５０的农杆菌中，成为适合本研究的双元载体。以叶圆盘转化法将外源基因转入烟草，获得了２种转基因植株。经ＤＮＡ分子杂交、ＮＰＴⅡ点分析、ＧＵＳ荧光定性及定量分析，证明外源基因已整合进烟草基因组并获得表达。ｐＬＢ３８的ＧＵＳ表达量为ｎＢｌ１２１的３～４倍，这表明启动子数目的不同会直接影响其启动基因的表达水平。     

AcNPV增强子hr5增强HBsAg基因表达的研究

用形成包涵体（ＯＯＣ＋）并能利用人工合成启动序列和多角体ＸＩＶ启动子表达外源基因的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３将多角体基因、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢＳＡｇ）基因和苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的增强子ｈｒ５部分序列同时插入无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－Ｇ基因组中，得到两株高效表达ＨＢｓＡｇ基因又形成包涵体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋．对重组病毒的酶切鉴定、ＤＮＡ斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证实，外源基因及其相应的启动子和增强子序列已正确插入病毒基因组中．插入顺序中，ｈｒ５增强子是插入ＨＢｓＡｇ基因下游，多角体基因与ＨＢｓＡｇ基因方向相反．１２５Ⅰ－固相放射免疫检测和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，ＨＢｓＡｇ基因在昆虫离体细胞中得到高效表达并保留了抗原活性．ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ２６－ＯＣＣ＋和ＴｎＮＰＶ－ｓｈｒ３５－ＯＣＣ＋表达的ＨＢｓＡ吕蛋白与没有插入增强子序列的重组病毒ＴｎＮＰＶ—ＨＢｓ８５－ＯＣＣ＋的比较，分别提高了４０％和４６％．     

致弱I型MDV pp38基因同源物的克隆和序列分析

将致弱Ｉ型马立克病病毒（ＭＤＶ）感染的细胞基因组ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ酶切产物建于ｐＵＣ１８质粒载体文库中,以ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ标记的含有中毒ＧＡ株ＭＤＶｐｐ３８基因克隆片段作为探针,进行了原位杂交反应,初步筛选出阳性重组质粒,进一步用ＥｃＲＩ酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组ｐＵＣ１８质粒,序列人析表明该ｐｐ３８基因同源物与ｐｐ３８基因有极高的同源性,仅有１个碱基突变并导致１个氨基酸的夫     

将GNA基因导入莴苣（L.sativa）及其表达的研究

将含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的雪花莲凝集素基因置换Ｔｉ质粒载体ｐＢＩ１２１中的ＧＵＳ基因得到了ｐＢＩＧＮＡ质粒,将其导入农杆菌ＬＢＡ４４０４,得到ＬＢＡ４４０４菌株。     

Bc1-2 基因加强表达对 OA 诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞进行编程死亡．死亡细胞缩小变圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（ＣＨＸ）抑制．将编码Ｂｃ１－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４１ｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制．形成的顺义（ｐＢｃｌ－２－Ｓ）及反义（ｐＢｃｌ－２－ＡＳ）表达质粒经转染导入ＳＫ细胞中获得稳定转染子，Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ印迹表明顺义转染子表达较大量的２６ｋｄＢｃ１－２蛋白，而反义转染子则不表达．增强表达的Ｂｃ１－２基因产物对ＯＡ引ＳＫ细胞编程死亡无抑制效应．     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达？…

在昆虫病毒转移载体ｐＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２。随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动子驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１ｎｅｏ和ｐＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重     

人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器的研制

为了建立人凝血Ⅸ因子乳腺生物反应器，以ＭＣＫ增强子，β－ａｃｔｉｎ启动子控制ｈＦＩＸ小基因表达顺序，反向插入Ｇ１Ｎａ框架，构建复制缺陷反转录病毒载本，并制备重组反围录病毒颗粒；     

启动子探针型载体的构建

用ＤＮＡ重组技术构建了启动子探针型系列载体ｐＳＵＰＶ１，ｐＳＵＰＶ２和ｐＳＵＰＶ３，它们是以大肠杆菌质粒载体ｐＢｌｕｅ或ｐＵＣ１８为骨架，ｐＮＧ３５中的卡那霉素抗性（Ｋａｎ＇）基因为标记构建而成。这些载体可用于原核生物、真菌及高等真核生物基因启动子的分离鉴定，并也可用于对已克隆基因启动子的进一步鉴定。     

MDVⅠ型疫苗株pp38基因同源物在家蚕细胞中的表达

用ＰＣＲ技术,从马立克氏病病毒ＣＶＩ９８８／Ｃ株感染的鸡胚成纤维细胞基因组ＤＮＡ中扩增出含起始密码子的ｐｐ３８基因同源物编码序列,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ中,ｐｐ３８基因探针能识别为该ＰＣＲ扩增片段。将该扩增片段克隆进ｐＵＣ１８质粒载体,并进行了全序列分析,进一步将该基因克隆入转移载体ｐＢａｓｃＰＡＫ８中,得到重组转移载体质粒,经酶切分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ确证了插入方向和正确性,以重组转移载体与经ＣｕｎⅠ酶切线性化的亲本病毒ＤＮＡ通过脂质体法共转染家蚕细胞,通过白斑结合点杂交,筛选出纯化的重组病毒,用间接荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞,可见感染细菌的胞浆及胞膜出现强荧光反应。     

35S启动子组入蓝藻质粒载体pUC13－pbl

３５Ｓ启动子组入蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐｂｌ楼士林，郭奕斌，吴巧娟（生物学系）近年来构建了一些含３５Ｓ启动子的质粒载体￣［１］，但未见含３５Ｓ启动子的蓝藻质粒载体．因此本研究拟把ＣａＭＶ的３５Ｓ启动子组入由孙立春等人构建的蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐ...     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

人肿瘤坏死因子穿梭表达载体的构建

应用ＤＮＡ重组技术,将人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ插到质粒ＰＲＬ４３９的ＰｐｓｂＡ启动子下游,得到中间载体ＰＲＬ＿ＴＮＦ;再把ＰＲＬ＿ＴＮＦ上含ＰｐｓｂＡ和（ｒｈＴＮＦ）ｃＤＮＡ的片段连到穿梭载体ＰＤＣ＿８上,构建成穿梭表达载体ＰＤＣ＿ＴＮＦ．转化大肠杆菌ＴＧ１后,进行发酵培养．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分析和免疫印迹检测结果显示ｒｈＴＮＦ获稳定表达,分子量为１７ｋｕ．本研究结果为ｒｈＴＮＦ在蓝藻中的表达提供了技术基础．     

EXPRESSION OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR α IN ANABAENA SP.PCC7120

通过三亲结合转移方式，将含人肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ＿α）ｃＤＮＡ和ｐｓｂＡ启动子的鱼腥藻－大肠杆菌穿梭质粒ＰＤＣ＿ＴＮＦ导入单细胞丝状鱼腥藻７１２０中．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，人肿瘤坏死因子αｃＤＮＡ在鱼腥藻７１２０细胞中能以自主复制形式存在于ＰＤＣ＿ＴＮＦ质粒上．ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和免疫印迹分析结果显示，转ＰＤＣ＿ＴＮＦ的鱼腥藻７１２０可表达分子量约为１７ｋｕ的人ＴＮＦ＿α，其表达量约占藻体蛋白的１６％左右．转ＰＤＣ＿ＴＮＦ的鱼腥藻７１２０粗提液的ＴＮＦ生物学比活性约为２５×１０４ｕ／ｍｇ．     

Bcl—2基因加强表达对OA诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞编程互亡，死亡细胞缩小为圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白南合成抑制剂环己酮抑制将编码Ｂｃｌ－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４ｌｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制。     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。