一种快速的重组农杆菌PCR鉴定方法

建立一种快速的重组农杆菌PCR扩增鉴定方法,采用煮沸法处理重组农杆菌,使农杆菌高温裂解,释放质粒DNA,直接进行PCR扩增反应,检测目的基因片段.结果表明,重组质粒PCR扩增效果较好,目标条带较为明显.通过煮沸重组农杆菌,进行PCR扩增反应鉴定质粒DNA,不仅实验操作简单安全,缩短实验时间,并且避免了酚、氯仿试剂在提取质粒DNA过程中的残留对后续分子鉴定质量的影响.     

北京鸭肝脏线粒体DNA的制备及性质

本文报导了一个从北京鸭肝脏大规模制备线粒体DNA(mtDNA)的方便的方法。从线粒体用0.8％SDS提取粗制的DNA后,用1M NaClO_4、氯仿脱蛋白,用2M NaCl除去大分子RNA,最后用Sepharose 4B柱凝胶过滤纯化mtDNA。对制得的产品用紫外吸收光谱、凝胶电泳、化学分析和电镜等方法进行了鉴定。鸭肝mtDNA为环形分子。对63个开环型mtDNA分子用电镜测量了长度,其平均周长为5.2±0.20微米。用质粒pBR322 DNA作为内部标准,测得37个mtDNA分子的平均分子量为16,660±350碱基对或(10.7±0.22)×10~6道尔顿。     

农杆菌质粒DNA高效提取方法研究

以EHA105菌株为实验材料,通过优化质粒扩增条件、加大菌液使用量、改良提取纯化过程中所用试剂等,简化了操作流程,给出了一种高效提取农杆菌中质粒DNA的方法。结果表明,选择LB＋KANA为培养基、抗生素质量浓度为50 mg/L,细菌培养至OD600=0.634～0.714时,以5 mL/次用量取菌液裂解;以改进方法提取试剂,得率与常规方法相当。该方法在满足PCR检测条件的前提下既减少了酚、氯仿等有毒试剂的用量,又省时、经济、方便,为植物转基因工程中目的物DNA的检测提供了技术支持。     

柚子转化的研究

本文报道一个简便的转化实验。柚子能被含Ti质粒的农杆菌感染。Ti质粒带有一个npt-Ⅱ基因和一个胭脂碱合成酶基因。卡那霉素抗性绿苗经NPT-Ⅱ酶活性测定和DNA分子杂交试验证明外源基因己导入柚子。     

碱裂解法提取质粒DNA方法的改进

对碱裂解法提取质粒DNA的方法进行了一些改进 ,在室温下裂解菌体和变性DNA ;用NH4 Ac和LiCl同步沉淀除去样品中的蛋白质和RNA ,降低了对超螺旋质粒的剪切作用 ,得到高质量的质粒DNA。     

几种农杆菌质粒DNA提取方法的比较

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法，得率较低，一般在50ng／uL以下。就经典的碱裂解法(方法一)和在碱裂解法的基础上改进的方法二(去除了酚、氯仿提取过程，减少了提取过程中对人的伤害，且缩短了提取时间)以及改进的方法三进行了比较，实验结果表明：改进的方法二更适宜于做PCR检测，而方法三则适合于重组质粒DNA的酶切、PCR鉴定等。     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U．Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列，设计1对引物，利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳，所得E1的片段略小于500bp，与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体，经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析，结果表明：克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％，说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的，为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。     

大麦黄矮病毒抗性基因的Ti质粒构建

通过酶切、连接、转化等技术 ,将大麦黄矮病毒抗性基因复制酶基因ORF2插入Ti质粒pGA4 82的T DNA区 ,从而提供了新的目的基因转化小麦的农杆菌 /质粒系统 .     

异戊烯基转移酶基因克隆及植物表达载体构建

根据已知的异戊烯基转移酶基因保守序列设计引物,以根癌农杆菌C58的Ti质粒为模板,采用PCR方法扩增获得了异戊烯基转移酶基因723bp的片段.将该片段回收,连接到pMD18-T载体测序,测序片段经酶切回收后克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α.将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105,经菌液和质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-ipt,这为异戊烯基转移酶基因功能的进一步研究提供了基础.     

一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法

依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.     

葵花籽粕中蛋白质提取工艺的优化

采用盐提法提取葵花籽粕中的蛋白质,以提取率为评价指标,采用单因素试验探讨NaCl浓度、料液比、提取温度、提取时间、pH值、提取次数对蛋白质提取率的影响,采用正交试验优化提取工艺。结果表明:葵花籽粕中蛋白质的最佳提取工艺条件为NaCl浓度1.5mol.L-1、料液比1∶14(g.mL-1)、温度50℃、提取时间1.5h、pH值8、提取2次,此条件下蛋白质提取率为54.8%。     

质粒pcDNA3.1-IL-24的制备和纯化

探索基因治疗用质粒pcDNA3.1-IL-24的规模化制备和纯化工艺。碱性裂解提取质粒后,以异丙醇和LiCl沉淀法去除大分子RNA。然后,使用DEAE Sepharose FF离子交换层析去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。经本工艺纯化的质粒pcDNA3.1-IL-24浓度为727μg/mL,纯度为1.87,蛋白质含量为0.007μg/mL质粒DNA,未检测到RNA、抗生素残留。此工艺避免使用动物源性酶类及有毒试剂,有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可实现药剂水平质粒DNA的规模制备。     

米渣营养成分测定及其蛋白质提取工艺优化

以大米为对照,测定了米渣的营养成分,并对碱溶酶解法提取米渣蛋白质的工艺进行优化。以蛋白质提取率为指标,首先通过单因素实验确定提取条件,然后采用正交试验设计优化碱溶工艺和酶解工艺,并分别采用线性模型和二次多项式模型进行回归拟合。实验结果显示,米渣蛋白质提取条件为米渣粗粉质量与碱溶液体积的比例是1∶12g/mL,碱溶pH值为12.5,米渣粗蛋白质量与碱溶液体积的比例是1∶10g/mL,酶解pH值为10.0,碱性蛋白酶的w(酶)为2.0%,在此最优条件下,蛋白质的提取率可达21.35%。二次多项式拟合方程式能很好地拟合碱溶酶解法提取米渣蛋白质的过程,决定系数R²=1.000。     

溶菌酶提取工艺

存在于蛋清中的溶菌酶是等电点在pH=10.5～11.0的强碱性蛋白质,分子量14000道尔顿。其有效的消炎抗菌作用使其成为医学临床上的抗菌剂和食品工业中的防腐保鲜剂。有关溶菌酶的提取技术国内虽有报道,但存在提取率低,处理量小和产品比活性低等缺点。本文参考国外有关溶菌酶最新提取技术的报道,结合国内的实际情况,并通过多次试验,提出以国     

天仙子+烟草体细胞杂种愈伤组织遗传转化的研究

处于对数生长时期的五种野生型根癌农杆菌菌株分别与继代培养的天仙子+烟草属间体细胞杂种愈伤组织系共培养育后,在元激素条件下以不同的频率获得了离体转化的愈伤组织系.在转化组织内,根癌农杆菌 Ti 质粒上 T—DNA 编码的激素合成酶基因和冠癌碱合成酶基因得到了转移、整合与表达.     

转基因西洋参冠瘿组织培养基中人参皂苷类成分的分离鉴定

西洋参冠瘿组织是本研究组利用植物转基因技术将根癌农杆菌(Agrobacerium tumefacins)中Ti质粒上的一段DNA(Transferred DNA,T-DNA)插人西洋参植物细胞核基因组而得到的转基因植物组织.本试验在前期工作的基础上,从西洋参冠瘿组织培养基中分离得到5个化合物.经波谱解析,将其鉴定为:20-(R)拟人参皂苷PF11、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb3和胡萝卜苷.上述化合物均为首次从转基因西洋参冠瘿组织培养基中分离得到.     

影响南瓜种子蛋白溶出率几种因素的初步探讨

探讨了料液比、pH值、温度、时间以及介质等因素对南瓜种子蛋白质溶出率的影响 .结果表明 :蛋白质的溶出率受pH值、介质的影响较大 ,其次为料液比、浸提温度和浸提时间 .初步确定南瓜种子蛋白质提取的较佳条件为 :料液比 1∶1 0 0 ,pH值 1 2 0的碱性条件下 ,37℃浸提 1 0h .     

利用人内皮抑素基因构建植物表达载体及对烟草的遗传转化

将人内皮抑素(endostatin)基因重组于植物双元表达载体pGA 643,得到重组质粒pGE.用三亲融合法将其导入农杆菌LBA 4404中,采用叶盘法转化烟草,经诱导与筛选,获得了卡那霉素抗性植株.提取抗性植株总DNA,通过PCR扩增和Sou thern杂交检测,筛选出了整合有外源基因的转化植株.为进一步研究人内皮抑素在烟草中的表达及生物学功能奠定了基础.     

拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建

在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RT-PCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pMD/AtJ2.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.     

两种盐对质粒DNA提取的影响

随着基因治疗及基因疫苗的不断发展,质粒的需求量迅速增加。通过以pcDNA3为目的产物,考察了在其提取过程中硫酸铵和氯化钙的加入对pcDNA3收率的影响和对杂质的去除效果。实验发现:硫酸铵和氯化钙的加入都可以明显降低质粒提取液中蛋白质、RNA杂质的含量;但是氯化钙在降低蛋白质和RNA含量的同时也降低了质粒DNA的收率。硫酸铵是去除蛋白质、RNA杂质的良好试剂,同时能够保持较高的质粒DNA收率。当质粒提取液中硫酸铵浓度加入到2.5M时,质粒的纯化因子可达到10.2,而收率在90%以上。