杜仲叶片愈伤组织诱导及增殖培养条件的优化

以杜仲嫩叶为外植体,运用正交试验优选6-BA、NAA、2,4-D和PVP四种物质组合,进行杜仲愈伤组织诱导及增殖试验。结果表明:(1)这四种物质对杜仲愈伤组织诱导的影响顺序是6-BA>NAA>PVP,对增殖的影响顺序是6-BA>NAA>2,4-D。利用杜仲叶片诱导愈伤组织最佳培养基为MS+0.5 mg.L-16-BA+0.5 mg.L-1NAA+2%PVP。(2)增殖培养基中添加1.0 mg.L-16-BA+0.5 mg.L-1NAA+1.0 mg.L-12,4-D为最适增殖组合,能明显提高杜仲愈伤组织增殖系数。应用优化的杜仲愈伤组织诱导及增殖培养条件,能获得较大量的愈伤组织,使规模化生产杜仲有效成分成为可能。     

基于转录组数据对糙苏三萜皂苷合成途径的研究

糙苏为我国民间常用的传统草药,具有消肿、续筋接骨、祛风化痰、通络止痉、安胎等作用,三萜皂苷类化合物为其主要的生物活性成分.对糙苏组织转录组测序,挖掘其三萜皂苷生物合成途径相关基因,探究糙苏三萜皂苷化合物生物合成的分子基础.利用Trinity软件对测序结果获得的Unigenes数据进行过滤组装,并结合KEGG、GO数据库对Unigenes进行注释,预测糙苏三萜皂苷代谢的生物合成途径关键基因.结果获得了参与萜类化合物骨架生物合成的Unigenes数量为73条,39条Unigenes编码19个与萜类生物合成的关键酶,且有23条基因参与萜类物质骨架代谢途径(途径编号为ko00900),19条基因参与了倍半萜类物质代谢途径(途径编号为ko00909),涉及萜类物质骨架合成代谢途径相关酶共有15种,以及三萜代谢途径相关酶有10种.本研究获取了糙苏的三萜皂苷合成相关候选基因核苷酸和氨基酸序列,为糙苏三萜皂苷物质体外表达和生物合成奠定理论基础.     

青大1号紫花苜蓿愈伤组织的诱导

为了探讨青大1号紫花苜蓿愈伤组织的最佳诱导条件,本文以MS培养基为基本培养基,分别选用青大1号紫花苜蓿的种子、无菌苗的叶片、根为外植体,通过改变MS培养基中生长素(2,4-D)和细胞分裂素(6-BA)的配比以及光照条件,研究影响紫花苜蓿愈伤组织形成的条件因素。结果表明:在25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,选用种子为外植体,在添加40μmol/L 2,4-D和15μmol/L 6-BA的MS培养基上愈伤组织诱导率为92.5%;选用叶片为外植体,在添加45μmol/L 2,4-D和10μmol/L 6-BA的MS培养基上愈伤组织的诱导率为45%;选用根为外植体,在添加10μmol/L2,4-D和2.5μmol/L6-BA的MS培养基上愈伤组织的诱导率为40%;全日照或者全黑暗都不利于紫花苜蓿愈伤组织的诱导。继代培养发现,25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,10μmol/L 2,4-D的MS培养基上最适宜紫花苜蓿的愈伤组织继代生长。青大1号紫花苜蓿愈伤组织形成的最佳组合为:选用种子为外植体,25℃光照/黑暗(16 h/8 h)条件下,添加40μmol/L 2,4-D和15μmol/L 6-BA的MS培养基进行诱导,10μmol/L 2,4-D的MS培养基进行继代生长。     

真菌绿原酸的生物合成途径解析及调控策略

绿原酸具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等生物学功能。为提高真菌中绿原酸的生物合成量,实现真菌的提质增效,本文综合分析植物与真菌绿原酸的生物合成过程及其异同,绘制了绿原酸的生物合成途径;比较目前提高绿原酸合成量的方法,发现逆环境胁迫是积累绿原酸的关键。在培养真菌的过程中,可通过UV-B处理、增加光照强度、适当的光照时长、蓝光照射、低温胁迫、干旱胁迫等物理处理来调控其生长代谢,或者施加外源激素或转录因子刺激绿原酸生物合成途径中关键调节酶的过量表达,如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰基转移酶(HCT)及羟基化肉桂酰转移酶(C3H)等,这些酶的过表达可增加绿原酸生物合成途径的流通量,进而提高真菌中绿原酸的含量。     

大鼠松果体N-乙酰转移酶基因的昼夜节律性表达

探讨12 h光照、12 h黑暗交替(LD)光制下松果体N-乙酰转移酶(NAT)基因的昼夜节律性表达。SD大鼠在LD光制下饲养4周后,在一昼夜内每隔4h采集一组松果体组织,提取总RNA,进行竞争性定量RT-PCR,测定不同昼夜时点(ZT)样品中NAT基因mRNA的相对表达量。用余弦函数获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果表明松果体NAT基因mRNA表达呈现昼夜节律性振荡(P<0.05),峰值(mRNA水平为1.07±0.23)和谷值(mRNA水平为0.61±0.15)分别位于ZT16和ZT4,峰值相位-241.80±14.94,振幅0.23±0.13,中值0.84±0.11。证实LD光制下松果体NAT基因存在明显的昼低夜高节律性表达。     

营养胁迫对拟南芥4CL基因表达的影响研究

将拟南芥分别播种在N,P,K,Ca,Mg,Fe和Sucrose营养元素缺乏的培养基上,在长日照(16 h光照/8 h黑暗)22℃条件下培养10 d,不同营养元素缺乏的培养基中的拟南芥幼苗表现出相应的的表型.通过GUS的组织化学染色和采用Q-PCR检测分析4CL1,4CL2,4CL3基因在不同营养元素缺乏植株中的表达差异...     

大鼠松果体钟基因Clock的昼夜节律性表达

探讨 12h光照、12h黑暗交替 (LD)光制下松果体钟基因Clock是否存在昼夜节律性表达。在LD光制下饲养SD大鼠 4周后 ,在一昼夜内每隔 4h采集松果体组织 ,提取总RNA ,进行竞争性定量RT PCR ,测定不同昼夜时点(CT)样品中ClockmRNA的相对表达量。用余弦函数获取节律参数 ,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果是松果体Clock基因mRNA表达呈现昼夜节律性振荡变化 (P <0 .0 5 ) ,峰值和谷值分别位于CT18和CT6 ,峰值相位- 2 6 8.76± 2 7.6 3,振幅 0 .4 2± 0 .14 ,中值 0 .99± 0 .10。证实LD光制下Clock基因在松果体中存在明显的昼低夜高节律性表达     

马尾松愈伤组织诱导条件的研究

采用马尾松(Pinus massoniana Lamb.)成熟合子胚为起始材料,经过0.1%升汞溶液7~9min消毒后,接种于WPM培养基上,在温度26℃,光照强度2 000~3 000 lx,光照时间16 h/d的条件下培养得到无菌苗.采用无菌苗的各器官作为外植体在光照条件下进行愈伤组织的诱导条件的研究,结果显示,以幼茎为外植体,在含GD 6-BA 4.0 mg.L-1 NAA 0.10 mg.L-1 0.3%~0.4%活性碳(CA) 500 mg.L-1水解酪蛋白的培养基上,愈伤组织诱导率可达到93%.     

光质和生长物质组合对怀山药零余子脱分化和再分化的影响

本文以怀山药优良品种“铁棍山药”为材料，研究了光质和生长物质的不同组合对零余子脱分化和再分化的影响．结果表明：(1)在愈伤组织诱导过程中6-BA与NAA的组合优于6-BA与2，4-D的组合；在6-BA 2mg/L(单位下同) NAA2和4培养基上，愈伤组织在白光和红光下出现的比较早，诱导率在白光、红光、黄光、蓝光、绿光及黑暗各条件下均能达到100％．(2)在愈伤组织分化过程中，在相同条件下的蓝光分化率最高(为100％)，红光和白光次之(分别为95％和91．7％)，绿光和黄光较低(分别为84．4％和75％)，黑暗最低(为22．6％)．     

在鹰嘴豆的果实组织中光合~(14)CO_2固定产物与有关酶的活性

尽管许多豆科植物,包括鹰嘴豆的果实组织进行光合CO_2的同化是众所周知的,但是,对于在这些组织中CO_2固定的途径,特别是对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC4、1、1、31)的作用还不够清楚。我们己从鹰嘴豆(Cicer arictinum L)的荚果壳、种皮(果实组织)及其苞叶中测定到一些卡尔文循珠和C_4代谢的主要酶的活性,光照和黑暗中~(14)CO_2固定速率和光合CO_2固定的最初产物。对1,5——二磷酸核酮糖羧化酶(EC4、1、1、39)和其它卡尔文循环的酶,即NADP~+——甘油醛—3—磷酸脱氢酶(EC1、2、1、13),NAD~+——甘油醛—3—磷酸脱氢酶(EC1、2、1、12)和5——磷酸核酮糖激酶(EC2、7、1、19)的活性和磷酸烯醇式丙酮羧化酶以及其他C_4代谢的酶,也就是说,对NADP~+—苹果酸脱氢酶(EC_1、1、1、82)、NAD~+—苹果酸脱氢酶(EC1、1、1、37)NADP~+—苹果酸酶(EC1、1、1、40)、NAD~+—苹果酸酶(EC1、1、1、39)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(EC2、6、1、2)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(EC2、6、1、2)的活性进行了比较。一般说来,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和其他C_4代谢的酶,在荚果壳和种皮中的含量比在叶片中的含量为高。荚果壳和种皮在光照和黑暗中~(14)CO_2固定的速率高于叶子。说明在果实组织短期的~(140CO_2同化,象主要标记产物一样产生苹果酸,标记的3—磷酸甘油酸却较少,而在叶片中主要产物合成为3—磷酸甘油酸。显然,鹰嘴豆在果实组织中是利用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再固定呼吸放出的CO_2。     

湘西州生境对杜仲叶绿原酸质量分数的影响

对湘西自治州7县1市多个采集点的杜仲叶绿原酸质量分数进行检测,考察不同生境对杜仲叶绿原酸质量分数的影响.试验结果表明,湘西自治州不同地区杜仲叶绿原酸质量分数存在明显差异,不同地区及同一地区不同采集点绿原酸的质量分数均存在差异.杜仲生长在海拔401~500m范围,坡向南坡,土壤种类为浅灰土壤,土壤母质为石灰岩或砂页岩的条件下,杜仲叶绿原酸质量分数较高.     

模拟酸雨对杜仲光合生理及生长的影响

研究了模拟酸雨对杜仲光合生理及生长的影响,结果表明:在系列模拟酸雨胁迫下,无论春、夏、秋季,杜仲叶叶绿素(Chl)含量和Chl a／b值随酸雨pH值降低而降低,呈显著正相关．pH 4．0～5．6酸雨在春、夏、秋季对杜仲叶Hill反应活力、CO2补偿点、光补偿点、光饱和点和最大净光合速率无显著影响,而在pH 3．5～2．5强酸雨胁迫下Hill反应活力逐渐降低,CO2补偿点和光补偿点明显升高,光饱和点、最大净光合速率则显著下降．另外, 酸雨各处理组最大净光合速率与杜仲总生物量、杜仲叶药用有效成分(绿原酸、桃叶珊瑚甙和总黄酮)含量呈显著正相关,表明酸雨通过影响杜仲光合生理活性,进而影响其生长和药用有效成分含量．     

杜仲叶与皮中绿原酸的正交提取对比实验

对四川道地中药材杜仲叶与皮中所含有的一种重要的生物活性物质绿原酸进行提取工艺研究.采用乙醇—水溶液体系作浸提剂,以绿原酸提取率为指标,考察温度、乙醇浓度、料液比、溶剂pH对提取工艺的影响.结果表明,杜仲叶绿原酸的最佳工艺条件为A3B2C3D1,杜仲皮的最佳工艺条件为为A3B1,在此条件下,杜仲叶中绿原酸提取率为3.324%;杜仲皮中绿原酸提取率为0.647%.     

绿原酸的分离纯化工艺研究

研究从杜仲提取物中分离纯化绿原酸的工艺,确定其分离纯化参数.采用料液比1∶20水超声提取,上聚酰胺柱分离,4BV15％乙醇洗脱,洗脱浓缩液调pH为1-2静置结晶,可得85％以上的绿原酸粗晶,再甲醇重结晶,可得97％绿原酸白色针状晶体.采用此工艺可以将杜仲提取物中绿原酸由20％分离纯化至97％,工艺适合工业化生产.     

杜仲叶中抗氧化活性成分的提取

以体外总抗氧化能力为活性跟踪指标,采用单因素试验研究了超声波提取杜仲叶中抗氧化物活性物质的提取条件。结果表明,杜仲叶中总抗氧化物质的最佳提取条件为:以20%乙醇水溶液为提取剂,料液比为1:18,提取40 min,提取2次。     

ASE-UPLC法同时测定杜仲制剂中3种成分

建立ASE-UPLC(快速溶剂萃取仪-超高效液相色谱)法同时测定不同杜仲制剂中京尼平苷酸(GPA)、绿原酸(CA)、松脂醇二葡萄糖苷(PDG)3种指标成分含量的方法.采用70%甲醇水,温度40℃,压力103.4MPa的ASE法提取;色谱柱Acquity UPLCBEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm);乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相;流速0.15m L/min;洗脱梯度:0~15min,70%B~90%B;检测波长237nm;柱温20℃.结果显示3种被测成分分别在选定的范围内线性关系良好;精密度、重复性良好,相对标准偏差(RSD)分别均小于3.0%;平均加标回收率在95.84%~102.69%,RSD均小于3.0%.表明所建立的方法快捷、准确、重复性好,可用于杜仲制剂中主要成分的含量测定.     

杜仲对不同光强度的适应性研究

研究了不同光强度下一年生杜仲幼苗的光合生理特性。自然光照、一层遮阴、两层遮阴和三层遮阴杜仲幼苗光饱和点分别为：２５ｋｌｘ，２０ｋｌｘ，１７ｋｌｘ和５ｋｌｘ；光补偿点分别为：４．５ｋｌｘ，４．３ｋｌｘ，２．５ｋｌｘ和１．８ｋｌｘ。随生境中光强度的减弱，叶绿素含量增加，；汁绿素ｂ比例增高。生长在弱光环境中的杜仲幼苗株高受抑，叶面积减小，ＣＯ＿２补偿点降低，固定同化ＣＯ＿２能力减弱，净光合速率较低，导致生物产量和桃叶珊瑚甙地含量降低，表明杜仲是喜阳生植物。     

模拟酸雨对杜仲叶膜脂过氧化及氮代谢的影响

研究了模拟酸雨对杜仲叶膜脂过氧化及氮代谢的影响。结果表明：杜仲叶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT)活性在春夏两季均随酸雨pH的降低而先后降;随酸雨降雨量增大和胁迫时间的延长,3种保护酶受抑情况夏季较春季严重,膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量与酸雨pH值呈显著负相关;春夏两季氮代谢关键酶硝酸还原酶（NR0和谷酰胺合成酶（GS）活性在一定pH值酸雨胁迫下随酸雨、pH值降低而降低,夏季2种酶活性下降率比春季高;可溶性蛋白质和总氮含量春夏两季与随酸雨pH降低（夏季可溶性蛋白质含量与pH值呈正相关）,由此可见,酸雨对杜仲叶膜脂过氧化及氮代谢产生了显著影响。     

制备型高效液相色谱法分离纯化绿原酸

采用制备高效液相色谱技术,从杜仲叶提取物中分离纯化得到高纯活性成分绿原酸.对制备色谱的洗脱方式、洗脱剂组成、浓度、洗脱速度等参数进行优化,提出并应用了流动相速度梯度洗脱方法.最佳操作条件为:采用流速梯度进行洗脱,流速先为28 mL/min,然后为45 mL/min;流动相为15%的有机酸B和 0.1%的有机酸E(体积分数);测定波长为254 nm;进样体积为10 mL;进样量为2500 mg.通过该工艺分离纯化,制备回收率为83.3%,相对标准偏差为3.1%,绿原酸的纯度达98.61%,同时可得到杜仲叶黄酮、桃叶珊瑚甙等副产品.     

淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮对维甲酸所致小鼠骨质疏松的实验研究

为研究淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮对实验性骨质疏松症小鼠骨代谢生化指标的影响,采用维甲酸灌胃造成小鼠实验性骨质疏松症模型,同时灌服高、中、低3种剂量的含有淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮的供试药,检测小鼠血清总碱性磷酸酶、血清羟脯胺酸／肌酐值等指标的变化．结果显示3个给供试药剂量组的血清总碱性磷酸酶含量与模型组相比均升高,而血清羟脯胺酸／肌酐值与模型组相比下降,高、中剂量有显著性差异．表明淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮对维甲酸所致小鼠骨质疏松症有一定的防治作用．