不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标(红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容)、细胞大小(红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值)及它们的显微结构进行了比较研究,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构.结果表明:在不同倍性鱼中,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高;血红蛋白无显著差异;在细胞大小上,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系;在红细胞的形态方面,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异.同时发现随着倍性的升高红细胞的短径/长径比值减小.在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞.但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ,Ⅲ两种类型,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞.对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析.     

不同倍性鲤科鱼Cyclin B基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼Cyclin B基因部分DNA序列.结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼cyclin B基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类cyclin B基因DNA片段序列进行比较分析.结果表明:由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750 bp,950 bp,720 bp和720 bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段(1200 bp和900 bp),三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段(1200 bp,900 bp和750 bp),每个DNA片段均含Cyclin B基因第2,3内含子和第2,3,4外显子.序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200 bp片段同源性分别为99.5%,98.9%,99.5%和88.7%,与母本900 bp片段同源性分别为97.5%,94.6%,94.2%和89.9%,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200 bp和900 bpCyclin B基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性.而三倍体和五倍体鲫鲂的750 bp Cyclin B基因片段与父本同源性分别高达98.6%和98.2%,说明其来自父本团头鲂.在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本Cyclin B基因片段序列消除现象.此外,用Cyclin B基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由Cyclin B基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析.     

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG-box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本(红鲫和鲤鱼)的Sox基因. 异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有4条带,大小分别约为200,600,900和 1900?bp,而其原始亲本的扩增产物只有3条带,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带. 回收雄性四倍体鱼600?bp扩增带,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码71个氨基酸残基的基因. 该基因与虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、蟾蜍(Xenopus laevis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等的Sox9基因相似性达97%,据此命名为Atsox9a. 通过计算机分析和RT-PCR方法确定该基因含有内含子,并获得其内含子的序列和剪切位点,此内含子剪切位点在进化上是保守的. Atsox9a对于研究异源四倍体鲫鲤性别决定和分化机制及脊椎动物性别进化具有重要的理论意义.     

不同倍性鲤科鱼CyclinB基因内含子克隆与进化分析

运用PCR扩增、克隆、测序等技术,分别获得三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、五倍体鲫鲂和团头鲂、草鱼、鲢鱼、鳙鱼等鲤科鱼CyclinB基因部分DNA序列．结合异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼CyclinB基因对应DNA序列,对不同倍性鲤科鱼类CyclinB基因DNA片段序列进行比较分析．结果表明：由相同引物扩增的染色体数为48的鲂、草、鲢、鳙鱼,只扩增出1条DNA片段,片段长度分别为750bp,950bp,720bp和720bp,而染色体数目加倍的红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、异源四倍体鲫鲂,扩增出2条DNA片段（1200bp和900bp）,三倍体和五倍体鲫鲂扩增出3条DNA片段（1200bp,900bp和750bp）,每个DNA片段均含CyclinB基因第2,3内含子和第2,3,4外显子．序列分析表明,四倍体鲫鲤、三倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂和五倍体鲫鲂与其母本1200bp片段同源性分别为99．5％,98．9％,99．5％和88．7％,与母本900bp片段同源性分别为97．5％,94．6％,94．2％和89．99／6,说明四倍体鲫鲤与多倍体鲫鲂1200bp和900bpCyclinB基因片段与母本红鲫同源性高,在进化上具有偏母性遗传特性．而三倍体和五倍体鲫鲂的750bpCyclinB基因片段-9父本同源性分别高达98．6％和98．2％,说明其来自父本团头鲂．在两性可育的异源四倍体鲫鲤和异源四倍体鲫鲂中存在各自父本CyclinB基因片段序列消除现象．此外,用CyclinB基因内含子3序列构建不同倍性鲤科鱼的系统进化树,结果表明,由CyclinB基因内含子序列构建的系统进化树可以正确反映亲缘关系较近的鲤亚科属间鱼类系统进化关系,而不适合亲缘关系较远的亚科间杂交鱼类系统进化分析．     

复合四倍体彭泽鲫胚胎发育的研究

分别用复合四倍体彭泽鲫的母本种彭泽鲫和父本种尖鳍鲤的精子与复合四倍体彭泽鲫的卵子授精,在Nikon体视显微镜下对它们的胚胎发育过程进行连续观察.描述了23个发育时期的主要形态特征,观察了不同水温条件对胚胎发育速率的影响,比较了复合四倍体彭泽鲫与异育彭泽鲫胚胎发育过程的异同.发现二者在受精卵的大小、受精后皮质颗粒、肌节对数、眼晶体形成时间、积温等方面都存在差异,复合四倍体彭泽鲫比异育彭泽鲫的胚胎发育历时要少.在上述研究的基础上,发现来自母本种和父本种的两种不同精子与复合四倍体彭泽鲫的卵子授精,得到的胚胎在发育过程中未表现出明显差异,暗示复合四倍体彭泽鲫的卵子在应答母本种和父本种精子时表现出相同的生殖方式,即雌核发育生殖方式.本研究的结果和结论与在人工复合四倍体异育银鲫中观察到的现象存在显著差异.     

新型三倍体鲫鱼—红鲫(♀)×四倍体鲫鲤(♂)

四倍体鲫鲤与二倍体红鲫交配形成了新型三倍体鲫鱼，该三倍体鲫鱼的体侧扁，近似纺锤形，体色为青灰色，无口须.它们的大部分可量比例性状和可数性状都介于父母本之间，并且一些可量比例性状超出亲本范围，体现出杂种特征.第一年养殖结果表明，把同规格三倍体鲫鱼和二倍体红鲫混养，三倍体鲫鱼生长速度比红鲫快11.11%.性腺观察结果表明三倍体鱼的性腺发育比普通二倍体鱼明显滞后，生殖细胞呈退化现象.与以前用四倍体鲫鲤和日本白鲫交配形成的三倍体湘云鲫相比，三倍体鲫鱼不但保持了生长速度快、不育的特点，而且表现出完全没有口须的鲫鱼类型的特征，这在细胞遗传和鱼类育种方面都具有重要意义.     

异源四倍体鲫鲤及其原始亲本Sox9基因HMG保守区内含子遗传变异性分析

参照不同物种中Sox基因HMG保守区序列设计简并引物,扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫(Carassius carassiusred var.)和鲤鱼(Cyprinus carpioL.)的Sox基因.对不同片段大小的Sox基因测序,结果表明,四倍体鱼中存在两个Sox9基因(Atsox9a和Atsox9b),红鲫和鲤鱼中只发现一个Sox9基因(Rcsox9a和Ccsox9b).这4个Sox9基因在HMG盒中均含有内含子,大小分别为413bp,703bp,401bp和714bp,其插入位点遵守GT-AG法则.其中Atsox9a与Rcsox9a,Atsox9b与Ccsox9b的内含子序列都具有很高的一致性,分别为94.4%和97.8%,这表明内含子序列变异率较低.有趣的是,根据它们的外显子所推导的氨基酸序列一致性均为100%.因此,四倍体鱼及其原始亲本Sox9基因HMG基序内含子不仅具有长度多态性,而且内含子之间存在遗传变异性,这为进一步探讨异源四倍体鲫鲤的起源和进化提供了重要的分子生物学证据,同时也为正确掌握内含子的位置信息,功能和进化起源有着十分重要的作用.     

人工四倍体鲤鲫的产生

在人工诱导的复合三倍体鲤鱼成熟个体中有极个别个体产出的卵既保留了原有的３套染色体,又能与一套外来精核融合产生四倍体。１９９７年人工产生的８０００多尾鲤鲫四位体鱼经细胞遗传学研究分析鉴定,结果所有的个体都有４套染色体组,染色体数目在１８５￣２１０之间,众数为２００,四位体比率为１００％,这表明人工复合三倍体鲤鱼的生殖方式十分独特,绝大部分个体的成熟卵可借助于外来精子的流动进行自然雌核发育;而有极个别     

不同进化历程下的异源四倍体小麦核型进化及其稳定性分析

以人工新合成、野生天然及栽培异源四倍体小麦为实验材料模拟四倍体小麦形成初期、自然进化及人工驯化等阶段，利用荧光原位杂交技术(FISH)对各群体进行核型的鉴定和比较分析.结果表明：新合成群体存在亚基因组间序列重组，重组位置主要集中在染色体长臂端部；野生天然群体积累了大量的序列重组，除3号同源群外，其他同源群均出现了近着丝粒区的片段渗入；栽培群体仍有新的重组现象出现，但与自然进化过程相比明显减少.各群体内的核型检测结果表明，人工新合成群体存在少量的染色体结构变化，野生天然和栽培群体则趋于稳定.本研究结果为明确多倍体作物在进化过程中的核型变化规律，了解其核型稳定程度提供重要的理论依据.     

人工四倍体鲤鲫成熟卵受精过程的扫描电子显微镜观察

以人工四倍体鲤鲫卵子和普通红鲤精子为材料进行人工受精，在受精后的不同时间以扫描电子显微镜观察卵子对精子的应答反应、受精孔形态、数量与大小以及受精过程等超微结构特征. 结果表明，四倍体卵子动物极的卵壳上仅有一个受精孔,但受精孔区域有5—6个似小山丘状的嵴状结构，而鲤却完全没有这种结构. 研究证实：四倍体鲤鲫成熟卵属单受精孔、单精受精类型，其特异的嵴状形态结构可作为区分普通鲤的标记表型.     

同源四倍体和异源四倍体的比较

研究了同源四倍体和异源四倍体适合度及近交衰退随世代的变化.结果显示,不论采取什么繁殖方式,亲代和子一代中同源四倍体的适合度都小于异源四倍体的,亲代和子一代中同源四倍体近交衰退都小于异源四倍体的;同源四倍体中,亲代和子一代的适合度及近交衰退相等,异源四倍体中亲代近交衰退大于子一代的.等位基因的显性水平与自然选择的程度对四倍体适合度与近交衰退的影响比交配系统大.     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

异源四倍体鲫鲤成熟性腺和红细胞超微结构观察

用透射电子显微镜观察了繁殖季节异源四倍体鲫鲤成熟精巢、卵巢和血液中红细胞超微结构.成熟精巢由许多小叶组成,小叶内可观察到精原细胞、精子细胞和大量成熟二倍体精子.精原细胞的细胞质内可见核糖体、内质网、线粒体和电子致密物质;支持细胞的细胞质中可见内质网和明显的可能与激素合作有关的颗粒状物质.二倍体精子由头部和尾部组成,头部内充满致密染色质,尾部中央轴丝具有典型"9+2"微管结构.成熟卵巢中Ⅳ和Ⅴ时相卵母细胞外包围着两层滤胞细胞;内层滤胞细胞伸出微绒毛深入透明带和卵黄膜内,并一直延伸到卵细胞的细胞质内.推断微绒毛具有物质和信息交流的功能.Ⅳ时相和Ⅴ时相卵母细胞内的卵黄具有两种形式,一种其外有囊泡包围,另一种外面没有.红细胞中32.43%的细胞核具有独特的哑铃状结构,超微结构显示这种哑铃状结构为细胞核的弯曲变形现象;少数红细胞核有一分为二的分裂现象.红细胞核的这些特征可作为区别四倍体鱼和二倍体鱼的重要标志.在亚显微水平证明四倍体鲫鲤具有正常的成熟精巢和卵巢,它们能够产生正常的二倍体精子和卵子,保证四倍体性能代代相传.     

复合四倍体彭泽鲫雌核发育生殖方式的 胚胎同工酶证据

复合四倍体彭泽鲫是在尖鳍鲤精子刺激的彭泽鲫雌核发育子代中发现的少数特殊个体．本文分别用母本种彭泽鲫和父本种尖鳍鲤的精子与复合四倍体彭泽鲫的卵子受精，得到两种胚胎FP和FS．采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术对两种胚胎10个时期的5种同工酶（LDH、MDH、ME、SOD和EST）进行比较分析．结果表明:两种胚胎的5种同工酶表型在谱带上完全一致，不同来源的精子对胚胎的同工酶表型没有影响．表明复合四倍体彭泽鲫可能继承了母本种的雌核发育生殖方式．     

用团头鲂精子诱导红鲫雌核发育的研究

用遗传失活的团头鲂（Megalobrama amblycephala）的精子诱导红鲫（Carassius auratus Red Variety）进行雌核发育的研究. 红鲫的卵子经适宜UV剂量灭活处理的团头鲂精子激活后，在0—4℃下冷休克40min抑制第二极体的排出使染色体加倍，获得雌核发育红鲫. 它们的受精率、孵化率及成活率分别为（52.6±3.0）%，（23.6±4.1）%和（15.7±3.4）%，其成活率明显高于用鲤鱼精子诱导红鲫雌核发育的成活率（11.3±2.2）%. 以外形特征、染色体数目及性腺发育程度为依据对雌核发育红鲫与对照杂交鱼进行了区分和鉴定，结果表明，Ⅰ龄鱼的体色为红色，染色体数目为100，性腺发育正常的个体为成功的雌核发育红鲫；而染色体数目为124或148，性腺发育滞后的个体为杂交鱼，其中三倍体鲫鲂是不育的（2年观察证明），而四倍体鲫鲂2年才能达到性成熟. 以鲤鱼的精子作为对照，着重讨论了团头鲂精子作为刺激源的优势，即能提高雌核发育鱼的成活率，并可简化对雌核发育鱼的鉴定，研究证明团头鲂的精子是一种非常有效的诱导鲫鱼进行雌核发育的刺激源.     

基于DNA含量的复合鲫倍性分析

通过对复合鲫血细胞DNA含量的测定,探讨了其倍性和产生机制等方面的问题.结果显示,复合鲫的DNA含量明显多于母本种彭泽鲫的DNA含量,且所测14尾中多数个体的DNA含量超过或接近四倍体的DNA含量,少数个体的DNA含量介于三倍体和四倍体之间.推测多数复合鲫个体为复合四倍体异育彭泽鲫,其染色体组包含母本彭泽鲫的全套染色体和父本单倍染色体组所产生的子代,少数个体可能为非整倍体.     

秋水仙素诱导越橘四倍体研究

用秋水仙素浸渍法及培养基添加法对南高丛越橘组培苗"3#"进行了四倍体诱导,结果表明:浸渍法诱变效果优于培养基添加法,获得的变异株系多为嵌合体,0.1%的秋水仙素茎尖浸泡24h为最佳诱变组合,存活率为70%,变异率为13.33%,四倍体植株率为6.67%.通过对茎、叶、气孔、保卫细胞、染色体数目以及叶绿素含量等形态生理指标的检测,证明四倍体较二倍体发生了显著变化.     

同源四倍体芦荟的诱导研究

取库拉索芦荟 ( Aloe vera L .)的茎段、叶片作外植体接种于 MS附加不同激素的培养基上 ,诱导出丛生芽、微块茎、愈伤组织 ,将丛生芽、微块茎、愈伤组织分别用浓度为 0 .0 1% ,0 .0 2 % ,0 .0 5 %的秋水仙素以不同的方法和时间处理 ,丛生芽和微块茎能较好地诱出变异体 ,其中以 0 .0 2 %的秋水仙素棉球覆盖处理丛生芽 4 8h诱变效果最好 .变异体叶片肥厚、根粗壮 .筛选稳定的变异体继代 ,经染色体数目观察 ,二倍体植株染色体数目为 2 n=2×x=14 ,x=7,不同变异体染色体数目不同 ,其中 80 %以上的变异体细胞染色体数 2 n=4×x=2 8,x=7,为同源四倍体 .四倍体气孔器明显大于二倍体 .四倍体试管苗在 MS BA4 mg/l NAA0 .2 mg/l可以大量增殖 ,并于 1/2 MS NAA0 .3mg/l IAA0 .3mg/l培养基上诱大量根 .试管苗移栽成活率达 90 %以上 .     

利用乙醇脱氢酶基因证据揭示稻属CCDD异源四倍体中染色体组的起源

对稻属异源四倍体中染色体组C和D以及稻属现存的所有二倍体染色体组A、B、C、E、F的乙醇脱氢酶基因（Adh1）片段分别进行PCR扩增、克隆和序列测定，并以G染色体组序列作为外类群，采用PAUP运算软件中的简约性方法对所测定的序列进行了系统发育分析．结果表明：（1）3个CCDD四倍体是同一次杂交事件的产物；（2）四倍体中的C染色体组和亚洲二倍体中的C染色体组表现出更近的系统发育关系；（3）D染色体组和E染色体组表现出较近的亲缘关系，二者可能有共同的祖先．     

生命科学及其相关学科的研究（八）

阐述了含有人凝血因子转基因羊、应用细胞工程及有性杂交法培育异源四倍体鲫鲤鱼、基因对人类思维的作用、转基因植物生产人胰岛素、细胞衰老的决定因素、心肌细胞再生方法及基因工程灭蚊等方面的研究进展。