AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

拟南芥逆境响应蛋白SEP1的初步研究

为了研究拟南芥逆境响应蛋白SEP1的生物学功能,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了SEP1基因缺失的拟南芥突变体sep1-1.和从诺丁汉拟南芥种子库(NASC)购买的SEP1基因敲降突变体sep1-2一样,sep1-1在正常条件下与野生型没有明显差异.但是在1 200μmol photos·m^-2·s^-1高光处理8 h后,两个突变体新生叶片的叶绿体光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大量子产量(F_v/F_m)和野生型(WT)相比有着不同程度的下调,说明PSⅡ的活性降低.亚细胞和叶绿体精细定位结果表明,SEP1是叶绿体基质类囊体膜蛋白.通过蓝绿温和凝胶电泳(BN-PAGE)和二向(2D)SDS-PAGE/蛋白免疫印迹分析发现：SEP1与某些未知蛋白结合形成一个分子质量约为100 ku的复合物,它们可能共同参与了PSⅡ的组装或修复.     

拟南芥atfes1a突变体种子的热敏感性分析

根据基因芯片数据等生物信息学资料,我们锁定一些未知的且被高温诱导的基因,并获得了一个推测编码蛋白含armadillo/beta-catenin repeat(简称ARM)结构域的突变体salk-021784,该突变体缺失AtFes1A基因,该基因编码一种受高温诱导的ARM 蛋白.利用抗体检测了在拟南芥种子发育过程中AtFes1A的热诱导表达特征, 通过表型分析发现,热处理后的突变体种子萌发率明显低于热处理后的野生型,表明AtFes1A蛋白与拟南芥耐热有关.     

AhBG1转基因拟南芥的ABA敏感性和抗旱性研究

为探究花生基因AhBG1对拟南芥ABA敏感性和抗旱性的影响,以过表达AhBG1拟南芥为材料,检测其ABA敏感性及脱水处理下ABA质量分数、叶片失水率、干旱存活率及ABA稳态相关基因表达变化. 结果表明:AhBG1是编码花生β-葡萄糖苷酶的家族成员,定位于细胞质;与野生型相比,AhBG1过表达拟南芥植株在干旱条件下体内ABA水平提高,干旱存活率增加,增强有关生物合成途径和信号转导途径相关基因上调,抑制氧化代谢途径相关基因表达. AhBG1蛋白可能催化ABA-GE形成ABA,提高植物体内ABA的质量分数,通过影响ABA稳态相关基因的表达从而提高植物的抗旱性.     

RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.     

拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

对拟南芥氰丙氨酸合酶(cyanoalanine synthase,CAS)基因进行了生物信息学分析,并构建了CAS合酶基因的超表达载体,以期为其后续功能研究奠定基础。生物信息学分析结果表明,编码拟南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因均含有10个外显子和9个内含子,定位于3号染色体,而CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子,定位于5号染色体;3个基因编码的蛋白氨基酸序列相似度较高,CYS-C1蛋白偏碱性且主要在线粒体中起作用,而CYS-D1和CYS-D2蛋白偏酸性,主要在细胞质中起作用。通过RT-PCR扩增了拟南芥CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因片段,并构建了超表达载体p BI121-35S-CYS-C1、p BI121-35S-CYS-D1和p BI121-35S-CYS-D2,经检测重组质粒已转化到农杆菌GV3101中。     

风疹病毒E1抗原基因片段的拼接及原核表达

应用基因克隆技术,对风疹病毒E1抗原基因片段进行拼接及克隆表达．根据软件GOLDKEY预测E1抗原的主要抗原决定簇位点E1(243～286aa),再设计4条近60个碱基长引物,利用PCR仪延伸合成目的基因,酶切并构建重组表达载体,酶切与测序鉴定,再转化表达菌株BL21(pLYS),IPTG诱导表达,行SDS-PAGE检测到目的基因表达成功．结果实现了用基因克隆技术将含E1(243～286)片段的pETKDO载体向大肠杆菌的转化,IPTG诱导2h,获得的表达量高。     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。     

水稻组蛋白单泛素化连接酶基因(OsHUB1)的克隆及其表达分析

对模式植物拟南芥的研究发现,AtHUB1基因参与调控植物对灰霉病的抗性.为了研究水稻的抗病机理,笔者利用同源搜索从水稻数据库中获得了目标基因的序列,并通过RT-PCR技术从水稻中克隆了组蛋白单泛素化连接酶基因,命名为OsHUB1.该片段包含1个2 655 bp的开放阅读框,编码了1个885氨基酸的多肽.与NCBI数据库的比对结果表明:OsHUB1的氨基酸序列与短柄草(Brachypodium distachyon)、葡萄(Vitis vinifera)、杨树(Populus tomentosa)、大豆(Glycine max)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的泛素E3连接酶的同源性分别为78%,68%,68%,67%和62%.这些不同来源的组蛋白单泛素化连接酶都含有一个高度保守的RING指结构域.半定量表达分析结果表明:OsHUB1基因能够被水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)诱导表达,说明OsHUB1基因可能通过SA和JA介导的信号转导途径参与水稻的抗病反应.     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建与表达

人心肌肌钙蛋白Ⅰ(hcTnI)是临床检测心肌损伤及预后提供诊断的生物学指标,由于来源有限,采用基因重组技术,以期获得高表达量的人心肌肌钙蛋白Ⅰ.人工合成hcTnI基因,将其插入pET-11a载体中,通过酶切鉴定正确后转入表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.采用蛋白免疫印迹反应(Western Blot,WB)鉴定表达目的蛋白的免疫特异性.经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量约为2.6×104,凝胶密度扫描软件检测到目的蛋白占总蛋白比例为30.1%,WB实验验证诱导后目的蛋白特异性良好.成功构建了重组hcTnI基因在大肠杆菌表达的工程菌株,并获得表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用和测定标准化奠定了基础.     

棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化

为进一步探讨脱氢抗坏血酸还原酶的生物学功能,克隆棉花的脱氢抗坏血酸还原酶基因,对该基因进行了原核表达,并对重组蛋白进行纯化和分析。通过RT-PCR方法扩增脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,利用BamH I和Xhol I酶切位点将其克隆至组氨酸(histidine,His)融合蛋白表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(isopropy--βD-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物,并用亲和层析柱纯化重组表达的pET28a-DHAR蛋白。结果表明:重组体PET28a-DHAR经测序和酶切鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析目的蛋白高效表达,相对分子量为26 kD左右,并获得了纯化的His-DHAR融合蛋白。     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化

AHA2蛋白位于植物细胞质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达体系操作复杂,成本高昂.本文将拟南芥aha2基因(全长2984bp)插入真核表达载体pPICZαA中,线性化质粒pPICZαA-aha2,电转化毕赤酵母X33细胞,通过同源重组获得工程菌.以0.5%甲醇诱导表达72h后,收获细胞.冷冻研磨细胞,离心并收集上清进行亲和层析和分子筛纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白为97kD的条带.本研究成功的在毕赤酵母X33细胞中实现了拟南芥AHA2蛋白的表达和纯化.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

拟南芥RING finger结构域AtHHR1基因的功能初步研究

为了研究拟南芥基因AtHHR1(编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶)是否参与热胁迫响应,构建了athhr1/AtHHR1互补转基因株系.对突变体、互补株系及野生型进行热胁迫处理,发现突变体的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型,而互补株系均低于野生型.通过real-time PCR定量检测发现,热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型中高.研究结果初步表明AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用.     

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

嗜鞣管囊酵母adh2基因克隆及其原核表达

通过对不同酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的多重同源性分析比对,克隆出嗜鞣管囊酵母P-01(Pachysolen tan-nophilus)乙醇脱氢酶Ⅱ基因的一段长为340 bp的片段(EU570211).利用RACE技术,扩增出嗜鞣管囊酵母P-01adh2基因的全长ORF(1 056 bp).将基因与pMD18-T载体连接,验证后测序.经酶切、酶连到表达载体pET-20b并成功构建了基因的原核表达载体pET-20b-adh2,在E.coliBL21(DE3)中诱导表达出adh2重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,预期大小约为35 kD.