电击法转移含人凝血因子Ⅸ基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者含ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸ ｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动子控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动子驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１     

电击法转移含人凝血因子IX基因重组质粒的影响因素

反转录病毒载体在基因治疗中可能会产生野生型病毒颗粒而引起安全性问题，本文研究含ＦＩＸｃＤＮＡ重组质粒基因治疗血友病Ｂ的可能，构建了不具反转录病毒载体结构的两重组质粒ｐＳＣＩＸＴＮ和ｐＣＩＸＴＮ，前者合ＳＶ４０早期启动子和ｈＣＭＶ启动子共同控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，后者仅含ｈＣＭＶ启动于控制的ＦＩＸｃＤＮＡ，它们都含有ＴＫ启动于驱动的ｎｅｏ基因，通过电击法将基因转移到ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０细胞，在ＨＴ１０８０细胞中的ＦＩＸ表达量分别为２２０、２１２ｎｇ／（１０６细胞·２４ｈ）通过与ｐＣＭＶＩＸ共转染靶细胞，可以增加人ＩＸ因子表达１．５～３．５倍，显示了用质粒载体转染靶细胞在血友病Ｂ基因治疗中是一条潜在可行的途径．本项研究用自制的电击仪转移ＰＡ３１７和ＨＴ１０８０等细胞，最高的转移效率达１０－３，并探讨了细胞种类，ＤＮＡ量，ＤＮＡ结构，电压，脉冲时间与转移效率及表达量的关系．     

小鼠金属硫蛋白基因—I在CHO细胞中稳定表达及其在医疗…

将小鼠的ＭＴ－Ｉ基因插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＥｃｏＲＩ位点，构建了具有ＳＶ４０和ＭＴ双启动子并正向插入ＭＴ－Ｉ基因的表达载体。用改良的磷酸钙／ＤＮＡ沉淀法将表达载体导入ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞内，用不含次黄嘌呤（Ｈ）和胸腺嘧啶（Ｔ）的选择培养基筛选出稳定表达ＭＴ阳性克隆Ｄ－２２，经检测１０＾６细胞的ＭＴ表达量约为１．８μｇ，Ｄ－２２细胞对Ｃｄ＾２＋浓度抗性较之ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞高１４倍。     

基因免疫诱导小鼠对狂犬病病毒糖蛋白的免疫反应

将狂犬病病毒糖蛋白基因按正确方向插入真核表达载体ｐＫＳＶ１０及ｐＭＴ０１０／Ａ＾＋中相应启动子下游，构建成由ＳＶ４０早期启动子妄动的ｐＫＳＶＲｇｐ及羊金属硫蛋白启动子启动的ｐＭＴＲｇｐ两种狂犬病病毒糖蛋白表达载体。将两种重组体分别经小鼠两侧腿产肌肉按不同方案直接注射到１２只６－８周龄小鼠体内，成功地在注射小鼠血清内检测到抗狂犬病病毒抗体，而且注射２次的小鼠ＥＬＩＳＡ抗体滴度显提高，并且ｐＫＳＶＲ     

病毒载体滴度对基因转移效率的影响研究

用改良的经典方法测定包装ＬａｃＺ基因的腺病毒和逆转录病毒载体的病毒滴度，以及用新建的简便方法测定逆转录病毒载体的病毒滴度．应用此两种病毒载体介导ＬａｃＺ基因分别导入１５种人或小鼠靶细胞，并以不同滴度的病毒上清液转染靶细胞Ｋ５６２，探讨病毒滴度对基因转移效率的影响．实验结果表明，病毒滴度与转染效率呈正相关，逆转录病毒滴度由１０６ＣＦＵ／ｍＬ降至１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，用其转染Ｋ５６２细胞的转染效率由９０％降至２０％；ＣＡ启动子腺病毒滴度由０．４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ降至０．２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ时，对Ｋ５６２细胞的转染率由１００％降至３５％．同时表明，腺病毒滴度高，其转染率亦远比逆转录病毒高     

人免疫缺陷病毒Tat基因及LTR调控元件对基…

构建了不同长度人免疫缺陷病毒ＬＴＲ启动子的荧光酶报告基因（Ｌｕｃ）表达质粒；瞬时转染Ｊｕｒｋａｔ细胞；同时与含ｔａｔ基因的表达质粒ｐＣＶＩ共转染；通过荧光酶活性的测定，分析Ｔａｔ与ＬＴＲ对基因表达的作用机制。实验结果表明ＬＴＲ－１５８上游区有负调控元件的存在；证实了Ｔａｔ的反式激活作用可以大大提高ＬＴＲ指导的基因表达水平。研究结果提示ＬＴＲ中的增强子序列及其结合蛋白ＮＦ－ｋＢ在高水平的ＬＴＲ转录以     

反义多聚TAR对人免疫缺陷病毒I型TAT蛋白…

以ＨＩＶ－１ＴＡＲ的ＰＣＲ引物为自身模板，用ＰＣＲ法直接扩增得到多拷贝的ＴＡＲＤＮＡ同向串连体；构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ片段为启动子，含有４．８和１５个拷贝的ＴＡＲＤＮＡ反主表达质粒；以荧光素酶基因为报告基因，检测了瞬时共转染体系中不同拷贝数的反义ＴＡＲＤＮＡ转录产和对Ｔａｔ反式激活作用的抑制作用，结果表明，反义多聚ＴＡＲＲＮＡ对Ｔａｔ自古以来生具有很强的抑制作用，其抑制程度与反义ＴＡＲ中联体的     

Bcl—2基因加强表达对OA诱发的细胞编程死亡的效应

ＯＡ能诱发人神经母细胞瘤ＳＫ细胞编程互亡，死亡细胞缩小为圆，细胞质凝聚，ＤＮＡ有控降解成约２００ｂｐ左右的片段，且这一过程可由蛋白南合成抑制剂环己酮抑制将编码Ｂｃｌ－２全长蛋白质的ｃＤＮＡ植入ｐＸＪ４ｌｎｅｏ载体中，使其表达由ＨＣＭＶ病毒启动子控制。     

温控表达载体的构建及HIV—1 p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５，记载体携带ＰｒＰｌ串联温控启动子以及Ｈｉｓ－Ｔａｇ的纯化标签、利于目的蛋白的表达与纯化。将ＨＩＶ－ ｌｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列分别插入到ｐＶＶ５ｂ，ｐＥＴ２８ｂ的相应位点，构建了重组表达质粒ｐＥＧ１ｂ，ｐＢＧ７ｂ，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的４２％和２８％。     

人免疫缺陷病毒2型（HIV—2）穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ＨＩＶ－２）的原病毒基因组为模板,通过套式ＰＣＲ扩增得到了ＨＩＶ２的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,获得了重组表达质粒ｐＧＥＸ３６－ＥＮＶ．ＩＰＴＧ对重组表达菌株诱导后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生。     

云南省野生恒河猴病毒血清流行病学研究

对云南省野生恒河猴作了Ｂ病毒（ＢＶ）、猴爱滋病毒（ＳＩＶ）、猴Ｔ细胞白血病毒（ＳＴＬＶ）、猴Ｄ型逆转录病毒（ＳＲＶ）、轮状病毒（ＳＡｌ）、腺病毒（ＳＡＶ）、痘病毒（Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ）、麻疹病毒（Ｍｅａｓｌｅｓ）、柯赛基病毒Ｂ－１型（ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ１）和人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）等１０种病毒血清抗体及乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）检测,结果表明,云南省野生恒河猴中,抗体阳性率较高的有ＳＡ１１（９０％）,ＳＡＶ（８３１％）,ＢＶ（４４６％）和Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ（２０６％）;３种逆转录病毒的抗体阳性率分别为ＳＴＬＶ－１（８８％）,ＳＲＶ（４７％）,ＳＩＶ（２２％）;未发现Ｍｅａｓｌｅｓ,和ＣｏｘｓａｃｋｉｅＢ－１病毒血清抗体及ＨＢＶ感染,但在１只动物血清中有ＨＣＭＶ抗体．病毒抗体阳性率与动物的年龄有关,成年猴明显高于未成年猴．对来自思茅地区、临沧地区和文山州动物的调查表明,Ｂ病毒相关抗体和逆转录病毒抗体阳性率有地区差异,思茅地区的野生恒河猴,抗体阳性率较高．     

用PCR扩增和克隆鸡贫血病毒衣壳蛋白VP2基因

接种鸡贫血病毒（ＣＡＶ）Ｃｕｘ－１毒株于ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞中,并用经狄高辛标记的ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ１基因克隆ＤＮＡ作为探针在斑点杂交中检测和比较了各代细胞中ＣＡＶ ＤＮＡ水平。通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从ＣＡＶ ＤＮＡ水平较高的ＭＤＣＣ－ＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ＣＡＶ衣壳蛋白ＶＰ２基因片段约６５０ｂｐ的编码序列,将该ＰＣＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点克隆到ｐＵＣ１９质粒载体中,     

乙型肝为病毒（HBV）DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游,重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达,用纯化后的重组质粒直接注射用ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼细内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体,ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合。     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合     

hSOD基因在大白鼠肺上皮细胞中的表达

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ为运载体,构建了受控于ＣＭＶ启动子的ｈＳＯＤ基因的表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ＿ＳＯＤ,用脂质体转染法转染大白鼠肺上皮细胞Ｌ２细胞后,经抗生素Ｇ４１８选择性培养,获得与细胞染色体ＤＮＡ稳定整合的ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞,经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｓ分析,结果表明,ｈＳＯＤ在细胞中得到稳定表达,同时测定细胞ＳＯＤ酶活性,ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞的ＳＯＤ酶活性是空载体导入细胞和父本细胞的约２倍,并且在选择细胞克隆之后的６０天内是持续的．     

胸苷5′位修饰物的合成、表征及抗HIV活性

合成了两个胸苷５′位修饰物，即５′－叠氮－胸苷（５′Ｎ３－Ｔ）和５′－氨基－胸苷（５′ＮＨ２－Ｔ），以及３′－脱氧－２′，３′－二脱氢胸苷（Ｄ４Ｔ），对照物通过ＩＲ，ＵＶ／ｖｉｓ，１ＨＮＭＲ和ＭＳ等方进行了表征．抗ＨＩＶ活性试验表明，５′－Ｎ３－Ｔ与Ｄ４Ｔ对于ＨＩＶ－１感染的ＭＴ－４淋巴细胞具有较好的抑制作用，而５′－ＮＨ２－Ｔ′几乎没有活性．由于５′－Ｎ３－Ｔ缺少５′－ＯＨ不能磷酸化，可能其抑制ＨＩＶ复制的机理与Ｄ４Ｔ等其它核苷药物不同     

甜菜坏死黄脉病毒新疆分离物外壳蛋白基因的原核表达载体和植物表达载体的构建

将克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（＋）的甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）新疆分离物外壳蛋白（ＣＰ）基因的ｃＤＮＡ的ｐＧＥＢ３，用ＸｂａＩ切下，Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切下ｃＤＮＡ片段。用ＮｄｅＩ切开原核表达载体ｐＪＷ２，用Ｋｌｅｎｏｗ补平，再用ＢａｍＨＩ切去小片段。将该ｃＤＮＡ与ｐＪＷ２大片段用Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＮＹＶＶＣＰ基因的表达载体ｐＪＷＢ４，转化到大肠杆菌ＤＨ５α。经培养和高温诱导，ｐＪＷＢ４成功地表达出了ＢＮＹＶＶ的外壳蛋白。将ｐＧＥＢ３和ｐＢＩ１２１用Ｘｂａｌ和ＢａｍＨＩ酶切Ｔ４连接酶连接，构建了ＢＹＶＶＣＰ基因的植物表达载体，转化到ＤＨ５α，筛选出正向连结的阳性克隆ｐＢＩＢ３，转化入农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４），经用ＰＣＲ扩增和γ３２Ｐ标记的探针杂交约证实为阳性克隆。往甜菜植株中转化工作正在进行中。     

腺病毒介导的wtp53基因对五种癌细胞系的生长抑制 …

构建重组腺病毒载体ＡｄＣＭＶｐ５３，将ｗｔｐ５３分别导入ＰＧ（人肺巨细胞瘤细胞）、ＣＡＥ（人结肠癌细胞）、ＨＣＴ（人结肠癌细胞）、ＨｅＬａ９人宫颈癌细胞）及ＢＥＬ７４０２（人肝癌细胞）五种癌细胞中，测定ＡｄＣＭＶｐ５３对癌细胞的半抑制浓度（ＩＣ５０）和细胞生长曲线，分别不同组织癌组织对ＡｄＣＭＶｐ５３的敏感程度。结果表明，ＡｄＣＭＶｐ５３对癌细胞具有与病毒剂量相关的明显致死作用，但不同细胞对腺病毒     

重组腺病毒介导的基因转移系统的建立以及在离体及活体中表达

首先建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统：将质粒ｐＡｄＣＭＶｌａｃＺ用磷酸钙沉淀法转移至２９３腺病毒包装细胞中，经挑克隆、病毒扩增、纯化、浓度和滴度测定，制备了纯化的病毒颗粒ＡｄＣＭＶｌａｃＺ；以此感染离体细胞，ｌａｃＺ基因转移效率可达９０％￣９５％；小鼠被直接活体注射重组的腺病毒ＡｄＣＭＶｌａｃＺ，ｌａｃＺ基因能够在多种组织中表达。其次，运用重组腺病毒介导的基因转移系统，进行了人凝血因子ⅨｃＤ     

复制酶基因介导的抗病毒烟草植株的研究

将构建的携带烟草花叶病毒（ＴＭＶ）５４ＫＤ蛋白基因及黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）３’端缺失０．９Ｋｂ的１．６Ｋｂ片断复制酶基因植物表达载体ｐＢＩＣＴ，导入根癌农杆菌３１１ＳＥ系，用叶圆盘法转化烟草，在含有卡那霉素的选择性培养基上诱导生芽、生根，得到２８株成活苗．移入大田后，随机挑选４．株植物，提取植物总ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测，结果４株植物中都有复制酶基因的整合，而未经转化的对照组植物则没有．转基因植株在大田试验中表现了良好的抗烟草花叶病毒及黄瓜花叶病毒能力．