利用分子模拟技术筛选HLA-A2限制性CTL表位肽

以肿瘤抗原MAGE-2为例, 运用分子模拟方法对其4个优势候选HLA-A2限制性CTL表位进行初步鉴定, 再通过多肽结合实验对鉴定结果进行验证. 结果表明, 4个候选肽中有3个与HLA-A2分子有较好的亲和力, 进一步进行体外诱导CTL效应实验显示, 3个高亲和力的表位肽可在体外有效诱导特异性CTL效应. 利用计算机辅助鉴定CTL表位, 克服了以往筛选肽要将肽逐一洗脱下来的繁琐实验过程, 并且可直接观测到多肽复合物的结合模式, 该技术在筛选大量优势CTL表位中具有较大的应用价值.     

多表位-表位疫苗诱导多中和表位特异性的抗HIV-1抗体

针对HIV-1包膜蛋白的中和抗体在体外高度有效地抑制不同病毒株的侵染，但在体内只以很低水平存在，提出多中和表位-表位疫苗作为提高体内中和抗体水平及机体抗病毒变异能力的新战略，两种候选从中和表位-表位疫苗在猴体内能同时诱导出预先确定的多中和表位特异性的抗体，这些抗体能识别表位多肽、gp41多肽、V3loop多肽、rsgp41和gp120上相应的中和表位，此外，3个实验型表位疫苗的组合（另一种形式的多中和表位-表位疫苗）在兔体内也诱导出类似的免疫应答。上述实验结果表明：多中和表位-表位疫苗可能是一种能同时诱导多重抗病毒活性、抗HIV-1感染以及对付病毒变异的新战略。     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

恒河猴对人工设计的HIV-1 DNA疫苗的免疫反应

HAART对HIV/AIDS的治疗起到了重要的作用, 但研制有效的疫苗是解决该全球性问题的最终方案. 将人工设计的HIV-1多表位-p24 DNA疫苗质粒pVAX1-MEGp24大量制备并纯化后, 于0, 4, 8及18周肌肉注射免疫恒河猴, 分别在第3次免疫和第4次免疫后2周(第10与第20周)采集血液, 分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC), 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性, ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量, MTT法测定PBMC的增殖能力. 结果表明, HIV-1多表位-p24 DNA疫苗免疫组的恒河猴PBMC在恒河猴限制性HIV-1 CTL表位肽刺激下产生针对HIV-1靶细胞的特异性杀伤活性, 分泌Th1类细胞因子IFN-g和IL-2的水平升高, 并出现HIV-1特异性细胞增殖反应; 该重组疫苗同时能诱导恒河猴产生HIV-1特异性抗体. 结果提示, HIV-1多表位- p24 DNA疫苗能诱导恒河猴产生HIV-1特异性细胞和体液免疫应答.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

TFH细胞调控因子研究进展

滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell, T_FH)是CD4⁺ T细胞家族的新成员, T_FH细胞不但在辅助生发中心(germinal center, GC)形成和维持的过程中发挥重要作用, 也是辅助GC中B细胞分化为浆细胞的关键因素. 近年来的研究已证实, Bcl-6是调控T_FH细胞分化的重要分子, T_FH细胞通过分泌细胞因子IL-21而作用于滤泡B细胞, 以促其分化. 本文就调节T_FH细胞分化的主要因子及其作用机制作一综述.     

免疫多样性的遗传基础(Ⅲ)——MHC分子及其多态性

人、鼠等高等动物对侵入体内的抗原,具有高度有效的防御体系。在自然情况下,防御体系主要掌管两类反应:其一,产生与侵入体内的外来抗原进行特异性结合的抗体分子(图23A);其二,杀伤T细胞认识感染病毒的自身细胞(图23B)。在这两类反应中,MHC分子、T细胞受体和外来抗原三者引起的细胞之间的相互作用,有着重要意义。其中MHC分子因有多态性,因此在防御反应中,似以识别“己”与“非己”的制约分子身份发挥作用。近来,大多认为抗     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

H1N1流感病毒M1蛋白表位筛选及其在禽流感病毒交叉免疫中的作用机制

流感病毒,如2009甲型H1N1流感病毒(2009 pH1N1)以及发生跨种传播的H7N9禽流感病毒(H7N9)等的流行严重威胁了人类健康并造成了重大社会经济损失.自2009年以来, 2009 pH1N1作为季节性流感病毒的流行使得健康人群存在一定的T细胞免疫本底水平.本研究对2009 pH1N1和H7N9的主要T细胞免疫原M1蛋白存在的4个突变区段,利用ELISPOT试验确定了2009 p H1N1在这4个区段来源的T细胞表位多肽H1-M42 (LMEWLKTR), H1-M102(KLKREITFHGAK), H1-M202s (AMEVANQTR)和H1-M244 (MGVQMQRFK).同时,发现健康人群对H7N9来源的相应多肽预存有一定水平T细胞免疫,但低于对2009 pH1N1本身多肽的免疫水平.多肽与HLA分子的复性实验表明, H1-M102和H1-M244能够与HLA-A*1101稳定结合;而H1-M42和H1-M202s虽然能够结合HLA-A*3303,但H7N9相应的表位与这些分子的结合力相对较弱.结果表明,在健康人群中存在有限的针对H7N9的预存T细胞免疫,而H7N9在新鉴定表位多肽中的氨基酸突变对于免疫逃逸具有一定的贡献.对流感病毒交叉免疫的研究能够为了解禽流感病毒逃逸T细胞免疫机制以及通用流感疫苗的研发提供重要参考.     

表达新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因重组禽痘病毒的构建及其抑瘤作用

来源于新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuramidinase, HN)蛋白不仅能够介导受体识别, 还具有水解这些受体中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid, NAcneu, 唾液酸)成分的神经氨酸酶(neuraminidase, NA)活性. 研究表明, HN蛋白可针对包括人类在内的哺乳动物产生抗肿瘤作用和免疫刺激作用. 为探索HN基因在肿瘤基因治疗中的应用, 构建了表达HN的重组禽痘病毒(vFV-HN), 并通过体内外实验比较了其与野生型禽痘病毒(FPV)的抗肿瘤作用. 实验结果表明, 虽然B16肿瘤细胞对FPV感染所致细胞毒作用具有一定耐受性, 但vFV-HN具有显著的抑瘤作用. 并且, 与FPV相比, vFV-HN免疫可显著延长荷瘤动物模型的生存期. 另外, vFV-HN免疫可刺激产生B16肿瘤细胞特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和促进CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞的增殖. 研究还发现, vFV-HN免疫可刺激小鼠分泌IL-2和IFN-g等Th1类细胞因子, 说明vFV-HN的抑瘤作用与Th1类免疫反应相关. 实验结果提示, vFV-HN免疫具有潜在的肿瘤基因治疗研究价值.     

我国新生儿乙肝疫苗免疫后效应概述及相关问题

我国开展新生儿乙肝疫苗免疫接种后,随着全程接种覆盖率和首针及时接种率的逐年提高,婴儿围产期和幼儿时期乙肝病毒(HBV)的传播得到有效阻断,城乡儿童慢性乙肝病毒表面抗原(HBsAg)流行率和HBV感染率持续下降,儿童和青少年乙肝和肝癌发病率降低.疫苗抗原的特异性免疫记忆与青少年人群中所存在的持久免疫力和长期免疫保护效果相关,免疫记忆反应与疫苗接种者早期的乙肝表面抗体(抗-HBs)滴度水平相关.我们通过对江苏启东地区新生儿乙肝疫苗接种者长期连续性的随访研究结果表明,接受了新生儿乙肝疫苗全程免疫注射者在20岁之前尚不需要进行普遍性的加强免疫.本文还对江苏启东等地区疫苗接种人群中出现的HBV母婴传播阻断失败、抗-HBs无/低应答、HBV隐匿性感染、HBV基因型及基因变异和单项HBV核心抗体(抗-HBc)阳性等问题进行了讨论.     

剖析乙肝病毒的包膜——乙肝表面抗原的生物学功能及其致病机制

乙肝表面抗原作为病毒的包膜蛋白，在病人体内大量存在，甚至远远超过成熟病毒颗粒的含量。这表明表面抗原在乙肝病毒感染过程中具有特殊的作用，在乙型肝炎发病机制中扮演了重要的角色。笔者介绍了乙肝表面抗原在乙肝持续性感染致病机制方面的最新研究进展。     

苦味受体基因家族功能和演化研究的最新进展

苦味的识别作为一种防御机制, 能帮助动物避免摄入有毒物质, 它在动物的长期进化过程中起着至关重要的作用. 由于不同动物具有不同的生存环境和取食偏好, 使苦味识别能力在动物的长期进化中产生了分化. 苦味的识别源于苦味物质和苦味受体的结合, 所以对编码苦味受体基因的研究成为研究苦味识别的分子基础. 近年来, 随着体外功能实验体系的建立, 越来越多苦味受体的配体被发现. 另一方面, 随着许多脊椎动物基因组的测序完成, 人们对苦味受体基因家族的演化研究也取得了很大的进展. 对演化驱动力的研究, 能够使我们了解不同物种中苦味受体功能的变化趋势, 从而帮助我们发现更多的苦味配体. 本文主要介绍了苦味受体基因家族的功能及其在脊椎动物中演化的最新进展, 并对苦味受体基因家族今后的研究提出了展望.     

(顺)-3-(氯代亚甲基)-6-甲基-硫色满-4-酮的体外抗肿瘤活性研究

以生长抑制率为指标, 采用改良的MTT法检测新合成的(顺)-3-(氯代亚甲基)-6-甲基-硫色满-4-酮(CMMT)对12株人源肿瘤细胞系(A549, SGC-7901, BGC-823, U937, K562, Hela, MCF-7, HEPG-2, A375, LS174T, HT1080, C4-2B )增殖的影响. CMMT对12种细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)在0.41~6.05 ?g•mL⁻¹之间. 与同浓度的顺铂(CDDP)相比, 其抗肿瘤活性明显占优. CMMT能够明显抑制肿瘤细胞的生长, 具有极高的抗肿瘤活性, 研究结果为深入研究该类药物的体内抗肿瘤作用提供了有力的实验数据.     

代谢综合征药物高通量筛选模型的建立

线粒体对于真核细胞至关重要, 除了为细胞提供能量, 还参与细胞信号转导、分化与生长、凋亡等生命过程. 许多疾病的发生与线粒体功能失常密切相关, 包括神经退行性疾病、糖尿病、肥胖、肿瘤等. 由于线粒体膜电位是反映细胞功能状态的重要指针, 因此选用了代谢性细胞L6大鼠肌管细胞建立了一种快速且高效地分析线粒体膜电位的高通量筛选模型. 通过对线粒体染料JC-1浓度及孵育时间、待筛选化合物孵育时间、阳性化合物CCCP(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone) 浓度等实验条件的优化, 确立了筛选条件, 并对鱼藤酮、丙二酸、抗霉素A、寡霉素和黄连素(berberine)等线粒体抑制剂进行验证, 证实该筛选体系的可靠性. 以10 μmol L^-1 CCCP作为阳性对照, 筛选体系的整体CV值(变异系数)为5.92%, Z'因子为0.575, 符合高通量筛选的要求. L6肌管细胞线粒体膜电位高通量筛选模型的建立, 将为发现治疗代谢综合征的新药先导化合物提供更多机会.     

脂肪酶AK对富勒烯封端聚己内酯的降解

采用滴定法并以聚己内酯PCL为对照, 探讨了富勒烯封端聚己内酯C₆₀-PCL的脂肪酶AK降解行为. 实验发现, PCL和C₆₀-PCL的酶解反应均符合米氏方程, 其动力学参数Km 分别为0.75和0.16 mg•mL⁻¹, 最大降解速度Vmax分别为0.90和0.43 mL•h⁻¹. 在同等条件下C₆₀-PCL降解速率较PCL减小, 表明富勒烯的引入使聚己内酯难于被脂肪酶降解.     

人乳头瘤病毒及其疫苗研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一类能够感染皮肤和黏膜的DNA病毒. 到目前为止, 已有100多个已知的HPV型别, 其中至少有13个型别可以引起宫颈癌, 而且与其他生殖器癌和头颈部肿瘤相关, 这些型别被称为“高危型”. 两个最常见的高危型是HPV16和HPV18, 可以引起大约70%左右的宫颈癌. HPV (尤其是HPV6和HPV11)还可以引起生殖器疣, 这是一种外生殖器很常见的良性病变, 发生率很高. HPV感染是高度传染的, 尤其在性生活刚开始的时候, 传染性最高. 大部分人都会在他们一生的某个时间感染HPV. 除了HPV感染以外, 引起宫颈癌发生的因素主要还有免疫抑制、多胎生育、初次分娩年龄小、吸烟、长期使用激素类避孕药以及合并感染沙眼衣原体或单纯疱疹病毒等. HPV疫苗来自于病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs), 通过重组技术来制作完成. 它们不含有任何活的生物制品或DNA, 因此没有传染性. 2006年, 美国默克公司生产的四价疫苗(包含有HPV6, 11, 16和18的VLP)首先获得美国FDA颁发的营业执照; 随后, 英国葛兰素公司生产的二价疫苗(只包含有HPV16和18的VLP)也在全球许多国家获得营业执照. 这些疫苗主要是为了保护人群不感染疫苗中包括的HPV型别及发生相关的疾病, 但对于已经感染的人群, 疫苗没有任何治疗作用. 疫苗在几乎所有被接种的人群中都可以诱导很高的血清抗体水平, 而且耐受性很好. 疫苗接种组在注射部位发生的副作用比对照组常见, 但严重副作用(serious adverse event, SAE)的发生率并不明显高于对照组     

部分苯酚衍生物生物降解性的2D和3D-QSBR研究

应用B3LYP/6-311G**水平计算得到的量子化学参数,在实验数据的基础上,建立了部分苯酚衍生物生物降解性能(二氧化碳生成量(PCD))的定量结构-生物降解性相关模型(2D-QSBR),该模型包括分子平均极化率(α)和熵(SΘ)两个参数,其中α对PCD的影响更为显著,模型的相关系数R2=0.933,交叉验证相关系数q2=0.894.该结果优于midix,6-31G*计算水平下得到的2D模型,此外,应用基于分子模拟技术的比较分子相似性指数(CoMSIA)方法,建立了3D-QSBR模型,模型的R2=0.964,q2=0.716,化合物的氢键供受体特性对降解能力的影响较为显著,其次是化合物的疏水性.结果表明,2D和3D-QSBR模型都具有良好的稳定性和预测能力,可以预测同类化合物的PCD值.