幽门螺杆菌鞭毛蛋白A单克隆抗体的制备与鉴定

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)鞭毛蛋白A(FlaA)可作为临床诊断标志物,但目前尚无识别FlaA蛋白的特异性抗体.该研究构建了HpflaA基因表达质粒,表达并纯化了HpFlaA重组蛋白,并以此重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备HpFlaA单克隆抗体,最后对抗体的亚型、效价、纯度、亲和力和特异性等进行鉴定.共获得5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G2、2G10、3E2、3E4和4H3.这5株细胞分型均为IgG1型且抗体效价均超过1∶10~5,亲和常数均达到10~7以上.经间接酶联免疫吸附实验和蛋白质免疫印记实验验证,单克隆抗体能特异性识别HpFlaA.成功制备出高亲和力、高效价、特异性好的HpFlaA单克隆抗体,具有潜在临床应用价值.     

脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备

目的: 为建立脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体．方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠．取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接 ELISA 法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化．用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价．结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株I型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体．间接ELISA 法测得单抗的效价为1∶8,中和试验测得中和抗体的效价为1∶58．结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体.     

人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体的制备与鉴定

 为了获得抗人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体,以重组hLIF蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的小细胞融合、无限稀释法制备了10株杂交瘤的腹水hLIF抗体,并对腹水进行了纯化.腹水粗品抗体经rProteinA一步亲和层析法纯化和鉴定后,抗体分子量都符合抗体的特性,抗体的纯度都达到了96.6%以上,抗体亲和常数在1.89×10-9~1.51×10-12mol/L,其中1B8a、5C1b、5G4a细胞株制备的抗体属于高亲和力抗体,可以对其的应用进行进一步的研究和探讨.     

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化.结果显示,可溶性部分以及经2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为150mM.纯化后重组蛋白的纯度在90%以上.     

抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备和鉴定

 以重氮反应将盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白偶联制备免疫原和检测原,通过杂交瘤技术获得了3株能分泌特异结合CL小分子的抗体杂交瘤细胞株.经竞争法ELISA分析,9E3抗体的IC50质量浓度为19.85μg/L,14C5抗体为1.65μg/L,16F4抗体为0.84μg/L.在与类似物的交叉性反应中,16F4抗体与沙丁胺醇的交叉反应性为0.26%,特布他林为0.04%,与非诺特罗、肾上腺素、去甲肾上腺素的交叉反应性都小于0.02%.因此,所制备的抗盐酸克伦特罗的抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

抗猪促卵泡激素小鼠源单克隆抗体的研究

用猪促卵泡激素(PESH)作为抗原免疫BALB/C小鼠。通过将免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O—Ag14)进行融合,建立了九株能稳定分泌抗PFSH单克隆抗体的杂交瘤细胞。其中三株杂交瘤细胞分泌的抗体被证实是对PFSH特异结合的,它们和另一种非常相近的垂体激素——猪促黄体激素(PLH)不结合。用有限稀释法对全部九株杂交瘤进行了三次亚克隆。有几种单克隆抗体被羟基磷灰石柱层析一步法从小鼠腹水所纯化。以聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测经纯化单克隆抗体制品的纯度。     

肾综合征出血热病毒单克隆抗体7C11的纯化与鉴定

为获得高纯度的抗肾综合征出血热病毒单克隆抗体,建立杂交瘤细胞株7C11两步纯化的方法并进行亚类及特异性鉴定。采用Balb/c小鼠制备7C11单克隆抗体腹水,辛酸-硫酸铵法初步分离纯化,蛋白G亲和层析柱进一步分离纯化并鉴定。经初步分离纯化后,单抗IgG纯度>80%,回收率>50%;经过Protein G层析柱二次分离纯化后,单抗IgG纯度>98%,回收率>50%。亚类鉴定为IgG1,且特异性较好。成功获得高纯度的抗HFRS单克隆抗体,为抗汉坦型肾综合征出血热抗原表位的鉴定、抗原物质结构与功能的关系等后续研究奠定基础。     

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒单克隆抗体的制备和分析

用纯化的斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus)的病毒核衣壳免疫小鼠,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,经筛选得到5株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。它们所分泌的单抗分属IgG1,IgG2a,IgG2b和IgG3等4种抗体亚类,其中1株单抗识别分子质量为41ku的病毒蛋白,其余4株单抗均识别31ku的病毒蛋白。胰蛋白酶部分酶解分析发现,31ku的蛋白的4株单抗分别识别至少3个不同的抗原决定簇。所有5株单抗均不与其他4种核型多角体病毒发生交叉反应。利用所制备的单抗进行了病毒在虫体中增殖动态的检测。这些单克隆抗体可用来深入研究病毒的流行规律和复制机制。     

改进双抗夹心ELISA用于筛选单抗杂交瘤细胞株

本文利用改进双抗夹心ELISA筛选一种可测定血清样品中与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗。用兔抗K102多抗经亲和层析纯化并包被后,加入用10%猴血浆PBS还原后的抗原K102,再加入杂交瘤细胞株上清液和HRP-羊抗鼠IgG、底物反应液筛选阳性单抗杂交瘤细胞株。结果用改进后的双抗夹心ELISA筛成功地选出6株能稳定分泌针对K102的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2D7、3E2、5F4、5F6、6B9;细胞株产生的单抗用ELISA法能检测出血清样品中的K102的浓度。提示改进的双抗夹心ELISA可用于针对与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗杂交瘤细胞株的筛选。     

抗人骨桥蛋白单克隆抗体制备及其特异性研究

利用RT-PCR技术克隆人骨桥蛋白(hOPN)基因,构建OPN原核表达质粒pET-32a(+)-hOPN,转化BL21菌株,经IPTG诱导表达重组人骨桥蛋白(rhOPN).以纯化的rhOPN为免疫原,免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS1融合.通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得抗人OPN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,以ELISA、Western blot对抗体特异性进行鉴定.通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别抗原位点进行分析.结果共获得2株抗人OPN单克隆抗体,分别命名为8F1和2B5,亚型测定皆为IgG1.通过细胞侵袭抑制试验检测,2株抗人OPN mAb皆能很好地抑制细胞迁移.本研究成功获得了抗人骨桥蛋白的特异性单克隆抗体,为进一步研究OPN蛋白在自身免疫病和肿瘤中的功能提供了重要的工具.     

抗Der p 2单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:建立Der p 2(屋尘螨Ⅱ类变应原)杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der p 2单克隆抗体进行鉴定.方法:用重组Der p 2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体.采用间接ELISA法、Western blot法确定单克隆抗体的免疫球蛋白的类型和亚类、相对亲和力、特异性,对单克隆抗体进行鉴定.结果:获得3株能稳定分泌高效价Der p 2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1B6为IgG1类,1G11、4B1为IgG2a类.间接ELISA法检测细胞上清效价为104~105,腹水效价为105~106.Westernblot试验证明3株单抗与Der p 2蛋白均有特异性反应.结论:成功制备了3株抗Der p 2的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立Der p 2蛋白检测和纯化的方法奠定了基础.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测。方法提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测。结果获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类。G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上。结论成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测。     

抗家蚕抗菌肽单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

首次报道了抗家蚕抗菌肽（一种小分子多肽）单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立．用ＦＰＬＣ纯化家蚕抗菌肽（ＡＢＰ）获得了电泳一条带的均一样品；将它与辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）偶联，以此偶联物免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠．以抗菌肽—牛血清白蛋白（ＡＢＰ－ＢＳＡ）做包被物ＥＬＩＳＡ筛选出５个阳性杂交瘤细胞株，冻存复苏后得到三个稳定分泌抗体的阳性细胞株，抗体ＩｇＧ亚型为ＩｇＧ２ａ．统计了杂交瘤的染色体数