联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因清除猪细胞表面异种抗原

猪细胞表面Galα1-3Galβ1-4GluNAc-R 结构(称为αGal 表位)是引起异种器官移植超急性排斥反应的主要原因, 被称为主要异种抗原, 由α1,3-半乳糖转移酶生成. α1,3-半乳糖苷酶特异性地水解αGal表位末端半乳糖, 可清除这种主要异种抗原; α1,2-岩藻糖转移酶与α1,3-半乳糖转移酶竞争底物的作用也可使Galα1,3-Gal 的生成量降低并阻止α1,3-半乳糖苷酶水解的产物重新生成Galα1,3-Gal, 也具有清除主要异种抗原的作用. 以猪胚胎成纤维细胞为靶细胞, 联合转导人α1,3-半乳糖苷酶和α1,2-岩藻糖转移酶基因, 获得的转基因细胞异种抗原清除率达84%, 转基因细胞染色体数目和形态正常, 为进一步获得低αGal 抗原的体细胞克隆猪奠定了基础.     

新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造

α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase,αNAGA)是进行人红细胞(reblood cell,RBC)A→O血型改造的工具酶.采用PCR法从国内临床标本的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型αNAGA基因,应用基因工程和蛋白质纯化技术获得足量高纯度的重组酶.重组酶分子量为49.6kD,专一性强,比活力高,在25℃及pH6.8条件下,1h内完全酶解1UA1型浓缩RBC(约100mL/U)需1.5mg酶,而1h内完全酶解1UA2型浓缩RBC仅需0.4mg酶.酶解后的A型RBC与抗A单克隆抗体、人源O型血清反应均不凝集,与A,B,O,AB等各型血清的主侧配血实验成功,主要稀有血型不变.流式细胞仪检测结果表明,酶解后A抗原和A1抗原消失,H抗原增加,证明A→O血型改造成功获得的酶解通用型RBC可以安全输给A,B,O,AB等各型受血者,不会因ABO血型不合发生输血反应.脑膜脓毒性金黄杆菌来源的αNAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶,具有良好的应用前景,对于提高输血安全性、消除血液偏型、节约输血成本、增强应急输血保障能力具有重要意义.     

Le~Y对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体AH6 [特异结合LeY 寡糖 ,Fucα1_2Galβ1_4 (Fucα1_3)GlcNAc_]为工具 ,采用明胶酶谱法 ,研究细胞表面的LeY 寡糖抗原与着床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶 (Matrixmetalloproteinase ,MMPs)之间的关系 ,从而进一步确定LeY 寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节 .结果显示 ,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的LeY 寡糖抗原被封闭后 ,都能导致MMPs的分泌减少 ,说明在LeY 寡糖抗原对胚胎着床过程的调节中 ,MMPs起着重要的作用 .认为LeY 寡糖抗原不仅参与胚泡和子宫内膜的识别 ,也通过某种机制调节胚胎着床的侵润过程     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组(-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其Km = 0.275, Vmax = 0.014 mmol@L-1@min-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

genistein抑制人TNF-α诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用. 以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC, 剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附. 这种抑制作用发生在hTNF-α激活PAEC的早期, 并且具有可恢复性. PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活. 流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达. 这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达, 以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附, 而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造

a-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalactosaminidase, αNAGA)是进行人红细胞(red blood cell, RBC) A→O血型改造的工具酶. 采用PCR法从国内临床标本的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型aNAGA基因, 应用基因工程和蛋白质纯化技术获得足量高纯度的重组酶. 重组酶分子量为49.6 kD, 专一性强, 比活力高, 在25℃及pH 6.8条件下, 1 h内完全酶解1 U A1型浓缩RBC (约100 mL/U)需1.5 mg酶, 而1 h内完全酶解1 U A2型浓缩RBC仅需0.4 mg酶. 酶解后的A型RBC与抗A单克隆抗体、人源O型血清反应均不凝集, 与A, B, O, AB等各型血清的主侧配血实验成功, 主要稀有血型不变. 流式细胞仪检测结果表明, 酶解后A抗原和A1抗原消失, H抗原增加, 证明A→O血型改造成功. 获得的酶解通用型RBC可以安全输给A, B, O, AB等各型受血者, 不会因ABO血型不合发生输血反应. 脑膜脓毒性金黄杆菌来源的?NAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶, 具有良好的应用前景, 对于提高输血安全性、消除血液偏型、节约输血成本、增强应急输血保障能力具有重要意义.     

genistein抑制人TNF-诱导的猪内皮细胞对人单核细胞和自然杀伤细胞的黏附

研究了蛋白质酪氨酸磷酸化在hTNF-α诱导猪主动脉内皮细胞(PAEC)黏附分子E-选择素(E-selectin)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达以及在增强人外周血单核细胞(PBMo)和自然杀伤细胞(PBNK)黏附中的作用.以选择性的蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)抑制剂genistein预处理PAEC,剂量依赖性地抑制了hTNF-α增强的PAEC对PBMo和PBNK的黏附.这种抑制作用发生在hTNF-α活PAEC的早期,并且具有可恢复性.PTKs活性测定表明genistein剂量也依赖性地抑制了hTNF-α对PAEC的PTKs的激活.流式细胞术PAEC表型分析指出genistein抑制了hTNF-α诱导的E-selectin和VCAM-1的表达.这些结果表明PTKs可以调节hTNF-α诱导的PAEC黏附分子E-selectin和VCAM-1的表达,以及hTNF-α增强PBMo和PBNK的黏附,而饮食来源的genistein可能会作为一种黏附拮抗剂在控制这种细胞介导的排斥应答中发挥作用.     

人外周血单个核细胞不同亚群对猪内皮细胞的粘附作用

细胞介导的免疫应答是异种器官移面临的主要障碍,细胞粘附是细胞间相互识别的第一步。采用流式细胞术粘附测定法研究了人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中单核细胞（Ｍｏ）、自然杀伤细胞（ＮＫ）和Ｔ淋巴细胞（Ｔ）对猪主动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）粘附的差异性,以及人细胞因子γ－干扰素或／和肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）预刺激ＰＡＥＣ２４ｈ对ＰＢＭＣ不同亚群粘附的影响。ＰＢＭＣ不同亚群对ＰＡＥＣ粘附能力大小以Ｍｏ,     

HLA-G抑制NK和T细胞介导的对猪内皮细胞的细胞毒作用

为了探索HLA-G分子在异种器官移植中的应用前景, 用RT-PCR方法从人胎盘组织中克隆了HLA-G cDNA, 构建了哺乳动物表达载体; 通过稳定转染, 获得了高效表达HLA-G蛋白的猪血管内皮细胞(PECs)克隆. 经细胞毒实验发现, HLA-G不仅可以抑制活化人NK-92细胞对PECs的杀伤, 其抑制水平达到或低于NK-92杀伤人脐静脉内皮细胞水平; 而且可以抑制异种抗原特异T淋巴细胞的细胞毒作用, 抑制率为59.1% ～ 88.9%. 因此认为HLA-G作为异种移植诱导免疫耐受的新策略, 不仅在延迟性排斥阶段起到抑制NK细胞作用, 而且在细胞性排斥阶段同样可以抑制T淋巴细胞作用.     

中国人红细胞乙二醛酶Ⅰ的遗传多态性及在PV、SLE及重IDDM病时的变化

乙二醛酶Ⅰ(glyoxakse Ⅰ,GLO)是广泛分布在动植物及微生物细胞中乙二醛酶系的第一个酶,可将生物体内的α酮基醛类转化为α羧基酸。人类红细胞GLO在凝胶电泳时呈现出三种常见的表型,分别称为GL01、GL02-1     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其K_m = 0.275, V_max = 0.014 mmol·L^-1·min^-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

一种病毒蛋白B细胞表位预测方法的建立

病毒蛋白抗原表位的预测对于设计免疫原性多肽、新型疫苗分子及诊断试剂均有帮助.但是,既往的预测方法并不多,且至少存在以下两方面的缺陷:(1)既往方法均基于一般蛋白质的实验结果,因此,到目前为止还没有1种专用于病毒蛋白的表位预测方法;(2)80年代后期以来,多肽固相自动合成技术和Geysen氏pin ELISA技术在免疫学的广泛应用、模拟位     

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H₅N₁毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位, 检测了人禽流感H₅N₁毒株NA基因核苷酸序列. 采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案, 辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析, 并用SPSS 13.0进行聚类和相关分析, 建立了一种统计学筛选程序, 预测了H₅N₁病毒NA蛋白的B细胞表位, 并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析. 预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价. 结果发现, 预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120~137, 81~84, 408~415, 273~282, 429~432, 356~368, 46~55, 146~155, 341~350, 198~209肽段, 提示它们是B细胞表位的优势区段; 含有糖基化位点NGT_126~128的120~137肽段为首选的NA蛋白抗原表位; H₅N₁毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失, 这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性, 而且抗原表位扩大(VEP_46~48→VEPISNTNFL_46~55). 采用SWISS-MODEL软件建立的N₁蛋白模型有助于评价抗原表位预测. 结果表明, 用多参数预测以及用统计学筛选H₅N₁毒株NA蛋白的B细胞表位, 可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据; 广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性.     

K-RRneo细胞生长与分化特性的检测

细胞分化实质上是基因的选择性表达和特异性蛋白质的合成.珠蛋白基因开启、血红蛋白表达是红系细胞分化的典型标志.当红系细胞癌变时这一分化特征丧失,机理未明.薛社普等经过大量的研究发现,骨髓瘤细胞与网织红细胞同种或异种间进行杂交后,在出现去恶性分化特征(癌基因表达抑制/关闭)的同时,往往伴有珠蛋白基因产物(血红蛋白)的表达.我们报道了兔网织红细胞与人红白血病细胞K_(562)融合后形成的K-RRneo细胞生长活动较     

α混合相依下非参数核回归的相合性

设{(Y_t,Z_t),t=0,±1,±2,…}为定义在概率空间(Ω,(?),(?))上取值于R~p×R~1的随机平稳序列,若E|Z_t|<∞,则回归函数(?)(y)=E(Z_t|Y_t=y)存在.设(Y_1,Z_1),(Y_2,Z_2),…,(Y_n,Z_n)为该平稳序列的一个样本量为n的实现,则(?)(y)的Nadaraya-Watson估计即(?)_n(y)=sum fron i=1 to n Z_i K(y-Y_i/h_n)/ sum from j=1 to n K(y-Y_j/h_n),这里h_n为正常数(窗宽),K(·)是R~p上的非负Borel可测核函数.本文中0/0定义为0.若Y_t=(Z_(t-1),…,Z_(t-p)＇,此在非线性时序中具有特别的兴趣,(?)(y)即为自回归函数.为讨论(1)式的渐近性质,文献中要求平稳序列具有一定的混合性,比较典型的有:(?)混合,ρ混合β混合,α混合.其中α混合具有特别的兴趣:首先由其他3种混合性可推出a混合,α混合是对序列相依较为宽容的限制;其次,在非线性时序中,在一些可验证的条件下,非线性模型具有几何遍历性(见文献[1,2]及An和Huang~1),Lu~(2)～4)等),由其可得β混合,从而α混合,且混合系数以几何速度收敛于0.基于这些,本文在α混合下讨论(1)式的渐近性.定义 称平稳序列{(Y_t,Z_t),t=0,±1,±2,…}为α混合,若α(k)=sup|P(AB)-P(A)P(B)|→0.(2)当k→∞时,其中(?)_a~b表示由{(Y_t,Z_t),α≤t≤b}生成的σ代数,α(k)称为混合系数.     

猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

LIF, VEGF, CD57和CD68在大鼠胚胎移入小鼠子宫后的表达

种间妊娠失败是异种克隆的主要障碍. 为探讨种间妊娠失败的原因, 将大鼠囊胚移入假孕第3天的小鼠子宫内. 以前的研究显示, 大鼠胚胎只能在小鼠子宫内发育到第9天. 本实验结果表明, 异种胚胎移植后母胎界面CD57和CD68分子表达较同种移植的增强. 免疫组织化学和免疫印迹研究均显示, 异种胚胎移植后白血病抑制因子(LIF)表达增强, 但血管内皮生长因子(VEGF)表达下降. 在体外共培养系统中, 大鼠外胎盘锥在小鼠子宫蜕膜细胞上黏附率、扩展率和扩展面积较同种的显著降低. 这些结果提示, 大、小鼠种间妊娠中免疫排斥反应增强, 异种胚胎侵入能力降低, 可能是导致大、小鼠种间妊娠失败的重要原因.     

磷酸三甲酯与α，β—不饱和酸铜（Ⅱ）形成的三元配合物的晶体结构和磁性研究

合成了磷酸三甲酯与丙烯酸铜(Ⅱ)和磷酸三甲酯与α-甲基丙烯酸铜(Ⅱ)两种三元配合物, 进行了元素分析、红外光谱、 电子反射光谱、ESR谱和变温磁化率等研究, 确定配合物的组成为Cu2A4[OP(OCH3)3]2, 其中A = CH2 = CH —COO-, CH2= C(CH3)—COO-. 测定了Cu2[CH2= C(CH3)— COO]4[OP(OCH3)3]2的晶体结构, 晶体属三斜晶系, P_1~-群; 晶胞参数: α = 1.05128(13) nm, b =1.7559(5) nm, c = 1.9479(3) nm, α = 91.263(14)°, β = 102.559(6)°, γ = 106.339(13)°; Z = 4; 最终偏离因子R = 0.0668. Cu(Ⅱ)具有畸变的四角锥形配位环境, 两个Cu(Ⅱ)由4个α-甲基丙烯酸根桥联, 在Cu(Ⅱ)的端位各有一个磷酸三甲酯分子以O原子配位. Cu(Ⅱ)—Cu(Ⅱ)间具有一个对称中心, Cu(Ⅱ)—Cu(Ⅱ)间距离为0.26098(6) nm. 变温磁化率研究表明两种配合物中Cu(Ⅱ)—Cu(Ⅱ)间具有强烈的反铁磁性偶合作用.     

甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构模建与构象表位分析

最近几个月来, 一种新型流感病毒H1N1在全球流行. 本文运用生物信息技术, 从NCBI发布的新型A H1N1流感病毒基因序列出发, 通过同源模建方法构建了HA蛋白三维结构, 利用自主开发的蛋白抗原空间表位预测程序SEPPA预测了HA蛋白潜在空间表位氨基酸, 并与以往流感病毒HA蛋白潜在构象表位进行了比较. 结果发现HA蛋白中58个氨基酸残基具有较强的免疫原性, 大部分在HA蛋白球状头部表面上聚集成簇, 构成空间抗原表位. 与以往流感病毒HA蛋白潜在空间表位相比, 虽然坐落位置相似, 但新的抗原表位在静电势性质上明显不同于以往流感病毒HA蛋白抗原表位.