大肠杆菌肠毒素的免疫学研究进展

大肠杆菌肠毒素分为耐热肠毒素（ＳＴ）和不耐热性肠毒素（ＬＴ），ＳＴ不具有抗原，而ＬＴ具有抗原性。ＳＴ是引起人、畜腹泻的重要致病因子。人们希望通过基因体外融合技术和化学偶联方法，使ＳＴ成为一种良好抗原。本文对此研究进展作了概述。     

肠道病原性大肠杆菌所致的犊牛腹泻

在日本犊牛腹泻可造成肉牛饲养业的重大经济损失。虽然这种病在病原学上是由各种病原菌引起的复合性病症,但肠道病原性大肠杆菌(EPEC)被证明是这种病的主要病原。由肠道病原性大肠杆菌引起的本病,其特点是细菌在小肠粘膜表面聚集并产生肠毒素。细菌借助特异性菌毛聚集。发现 K_(88),K_(99)和987P 型抗原的菌毛是动物肠道病原性大肠杆菌的聚集因子。关于犊牛的肠道病原性大肠杆菌,K99抗原的存在与肠毒素产生特别是耐热肠毒素 a(STa)的产生存在着正相关。     

耐热型产肠毒素大肠杆菌检测方法的建立及应用

为建立检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热型肠毒素STa和STb的纳米金PCR方法,根据ETEC耐热型肠毒素STa和STb的基因序列,用Primer 5.0软件设计了2对特异性引物,优化得到最佳反应条件,并进行灵敏度和特异性的测试.实验结果表明:本文所建立的体系均能扩增到目的条带,灵敏度为47.5 cfu/mL,且特异性良好;所建立的纳米金PCR方法在人工染菌实验中也获得了较高的灵敏度和特异性.     

川西北牦牛源产肠毒素大肠杆菌的分子流行病学调查

为调查川西北地区牦牛源产肠毒素大肠杆菌的流行情况,对采自川西北甘孜州和阿坝州的26份腹泻牦牛粪便样品进行大肠杆菌分离,分别以分离的大肠杆菌DNA和牦牛腹泻粪便样本提取的总DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,分析产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻中存在情况,同时比较两种DNA提取方法对产肠毒素大肠杆菌PCR检出率的差异;以分离自外表健康牦牛粪便的105株大肠杆菌DNA为模板,采用PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌黏附因子K99+菌毛基因片段,比较牦牛源产肠毒素大肠杆菌在外表健康牦牛和腹泻牦牛中的携带情况.结果:从26份牦牛腹泻粪便样本中共鉴定出84个大肠杆菌菌落携带K99菌毛基因,这些菌落分别来自所有26份牦牛腹泻样品,因此,牦牛腹泻样本100%分离并检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌;而粪便总DNA检测结果为K99+菌毛基因阳性率84.62%(22/26),粪便中提取的总DNA模板K99+菌毛基因PCR检出率略低于分离鉴定的细菌DNA检出率;105株外表健康牦牛粪便样本分离株中检测到携带K99+菌毛基因的产肠毒素大肠杆菌34株,检出率为32.38%(34/105),产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康牦牛粪便的检出率(P0.001).结果表明,产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中存在广泛,是引起牦牛腹泻的一种重要病原菌;以粪便中提取的总DNA为模板,可快速检测牦牛粪便中产肠毒素大肠杆菌的存在.     

大肠杆菌热敏肠毒素的检测及纯化

采用平板免疫溶血试验、兔回肠结扎试验,探讨了大肠杆菌耐热肠毒素制备的方法和检测方法。试验表明：平板免疫溶血试验能够快速灵敏地检测出热敏感肠毒素．并具有很强的特异性,比肠结扎试验灵敏度高,而且简便易行;试验将细菌接种到产毒素培养基上培养．进行增菌,然后离心取上清液,沉淀溶于PBS液中用多黏菌素B浸出,均用80％饱和度的（NH4）2SO4盐析,之后用SephadexG-100凝胶层析分离纯化,最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测热敏肠毒素的纯度。     

不同培养基对肠毒素大肠杆菌载体疫苗株免疫原性的影响

分别采用固体CFA培养基和液体LB培养基培养,全菌ELISA,口服免疫Balb/c抗体测定,评价肠毒素大肠杆菌抗原CFA/I,CS6和载体志贺氏痢疾杆菌LPS的免疫原性.结果表明:LB培养基培养不影响疫苗株抗原免疫原性.由此提示,LB培养基对肠毒素大肠杆菌载体疫苗生产是行之有效的.     

LTB的表达及其粘膜免疫佐剂活性分析

粘膜免疫是预防一些通过吸附粘膜组织侵入机体病原的很好措施,但粘膜免疫通常需要粘膜免疫佐剂,大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素的B亚基具有很好的粘膜免疫佐剂活性.本研究从大肠杆菌195菌株中扩增出LT(heat-labile enterotoxin)基因,测序后将其B亚基基因与pET32a连接构建了重组质粒pET32a-LTB,SDS-PAGE显示LTB(heat-labile enterotoxin B subunit)在原核细胞中得到表达,Western blotting和人神经节苷脂结合酶联免疫吸附试验(GM1-ELISA)结果表明,重组LTB具有抗原性和GM1结合活性.将其与禽流感M2e表位融合蛋白M2eHBc+混合通过滴鼻途径免疫小鼠,抗体检测结果表明,所表达的LTB能很好地提高共免疫抗原的粘膜和系统免疫应答.     

不同条件对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶活性影响的研究

耐热核酸酶作为产肠毒素型金黄色葡萄球菌的生长标志，对其研究具有重要的意义．本实验通过比较不同pH值、生长时间、Na^＋浓度、加热时间等因素对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶分泌及活性的影响．反映了耐热核酸酶是一种性质十分稳定的蛋白质，耐热核酸酶活性检测应用于加工处理食品的金黄色葡萄球菌污染方面具有重要意义．     

共表达KnobS蛋白与LTB蛋白的重组干酪乳杆菌构建

在干酪乳杆菌中表达减蛋综合征病毒纤维蛋白KnobS,并分析其抗原性。分别将编码减蛋综合征病毒主要免疫保护性抗原纤维蛋白KnobS与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入干酪乳酸杆菌分泌表达载体pMG36e-UP/L中,成功构建重组表达载体pMG36e-UP/LTB-KnobS,获得表达融合蛋白KnobS-LTB的重组乳酸菌干酪乳杆菌表达系统;经SDS-PAGE和Western-blot检测表明,有大小约41kD的蛋白表达,具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。在干酪乳杆菌中成功地表达了含减蛋综合征病毒抗原的融合蛋白KnobS-LTB,且具有较好的抗原性,为减蛋综合征病毒重组乳酸菌活菌口服疫苗的研制奠定重要的物质基础。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7紧密黏附素C300与LTB融合蛋白B细胞表位预测

目的 对肠出血性大肠埃希菌O157:H7紧密黏附素C300与黏膜佐剂不耐热肠毒素(LTB)融合蛋白二级结构及B细胞识别表位进行预测,为开发新型疫苗提供理论依据.方法 采用DNA star软件中的Protean预测软件对Intimin C300与LTB融合蛋白的亲水性指数、β-转角、柔韧性、表面可及性和抗原指数进行预测....     

Lactose binding to heat-labile enterotoxin revealed by X-ray crystallography.

Recognition of the oligosaccharide portion of ganglioside GM1 in membranes of target cells by the heat-labile enterotoxin from Escherichia coli is the crucial first step in its pathogenesis, as it is for the closely related cholera toxin. These toxins have five B subunits, which are essential for GM1 binding, and a single A subunit, which needs to be nicked by proteolysis and reduced, yielding an A1-'enzyme' and an A2-'linker' peptide. A1 is translocated across the membrane of intestinal epithelial cells, possibly after endocytosis, upon which it ADP-ribosylates the G protein Gs alpha. The mechanism of binding and translocation of these toxins has been extensively investigated, but how the protein is orientated on binding is still not clear. Knowing the precise arrangement of the ganglioside binding sites of the toxins will be useful for designing drugs against the diarrhoeal diseases caused by organisms secreting these toxins and in the development of oral vaccines against them. We present here the three-dimensional structure of the E. coli heat-labile enterotoxin complexed with lactose. This reveals the location of the binding site of the terminal galactose of GM1, which is consistent with toxin binding to the target cell with its A1 fragment pointing away from the membrane. A small helix is identified at the carboxy terminus of A2 which emerges through the central pore of the B subunits and probably comes into contact with the membrane upon binding, whereas the A1 subunit is flexible with respect to the B pentamer.     

Crystal structure of a cholera toxin-related heat-labile enterotoxin from E. coli

Examination of the structure of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in the AB5 complex at a resolution of 2.3A reveals that the doughnut-shaped B pentamer binds the enzymatic A subunit using a hairpin of the A2 fragment, through a highly charged central pore. Putative ganglioside GM1-binding sites on the B subunits are more than 20A removed from the membrane-crossing A1 subunit. This ADP-ribosylating (A1) fragment of the toxin has structural homology with the catalytic region of exotoxin A and hence also to diphtheria toxin.     

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因.融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒.测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础.     

大肠杆菌耐热性肠毒素（ST）的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素（ST）在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁。文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义。     

细胞色素P450与农药相互作用及其机理研究

综述了细胞色素P450的种类和功能多样性,介绍了细胞色素P450参与除草剂代谢及其作用机理．同时,简述了细胞色素P450 14DM与杀菌剂特异性作用的机制．报道了我们从抗除草剂的瑞士黑麦草中克隆CYP8181同源基因及其功能的研究,以及柑橘绿霉菌细胞色素P450 14DM基因的克隆表达．为深入研究杀菌剂作用细胞色素P450 14DM的机理从而设计以P450 14DM为特异性靶标的新型农药、以及进一步研究细胞色素P450酶系与除草剂代谢的关系打下了良好的基础．     

氯和二氧化氯联合消毒灭菌作用的研究

以配置的水样为研究对象考察了氯与二氧化氯单独及联合灭活大肠杆菌和细菌总数的效果,用Berenbaum公式判断了两种消毒剂联合作用的性质.结果表明,氯2.00mg/L作用30 min可灭活试验水样中大肠杆菌6.18个数量级,二氧化氯0.30 mg/L作用15min、1.50mg/L氯和0.20 mg/L二氧化氯联合作用10 min可以灭活试验水样中大肠杆菌7.18个数量级(100%灭活);2.00 mg/L氯单独作用30 min、0.30 mg/L二氧化氯单独作用15 min、1.50 mg/L氯和0.20 mg/L二氧化氯联合作用10min可将水样中的细菌100%灭活.用Berenbaum公式计算得出氯与二氧化氯联合消毒灭活水样中大肠杆菌时质量浓度比为0.39,灭活水样中细菌总数时的质量浓度比为0.85,因此氯与二氧化氯联合消毒对大肠杆菌和细菌总数具有协同灭活作用.     

百里香提取物抑菌作用影响因素的研究

以百里香提取物及百里香芳香油作为抑菌剂进行抑菌试验 ,结果表明 ,所用提取物对供试菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有不同程度的抑菌作用 ,低 pH能够加强抑菌剂的抑菌能力 ,而吐温 80和有机氮 (BSA)能大大削弱抑菌剂的抑菌能力 ,可望将其用于食品工业作为食品防腐和抑菌剂     

基于CAS理论的出版企业技术创新行为模式研究

基于复杂适应系统(CAS)理论,分析了出版企业技术创新系统是一个复杂适应性系统,论述了出版企业技术创新的行为模式。其中,基于复杂的刺激-反应原理,构建了出版企业技术创新系统的主体行为模式;基于复杂的适应-学习原理,构建了出版企业技术创新系统的整体行为模式;基于复杂的层次-涌现原理,构建了出版企业技术创新系统的演化行为模式。复杂性科学的非线性、非均衡、复杂整体论的新的思维模式,为研究出版企业技术创新的行为模式提供了一种新的视角。