高产乙醇酵母菌株的筛选及产醇发酵条件研究

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有乙醇耐受力高、发酵工艺成熟、生物安全性高等优点,广泛应用于生物乙醇的生产。但其不能有效地利用木糖,不满足工业化大规模生产的要求。本研究以实验室现有重组菌株为研究对象,从中筛选出能够有效利用木糖的乙醇高产菌株ZLYRHZ7,并对其产醇发酵条件进行了研究。结果表明,当培养基中葡萄糖和木糖含量比为1∶4,酵母浸粉5 g·L~(-1)、磷酸氢二钾2.5 g·L~(-1)、硫酸镁0.25 g·L~(-1)、硫酸铵2.5 g·L~(-1)、氯化钙0.25 g·L~(-1),pH 5.0,采用针孔胶塞,200 r·min~(-1)发酵72 h时,乙醇产量达到最高,为25.48±0.23 g·L~(-1)。该研究结果为生物乙醇的工业化生产提供菌株来源,有助于酵母菌株木糖代谢流分析。     

一株蜡样芽孢杆菌对麦麸降解作用的研究

通过测定发酵过程中发酵液的纤维素酶、半纤维素酶活、可溶性总糖和还原糖浓度以及底物残渣重、残渣结晶度、傅立叶红外光谱和表面结构的变化来研究蜡样芽孢杆菌(Bacillus sp.X10-1-2)对麦麸的降解作用。结果发现:菌体产酶的同时进行木质纤维素的降解和糖化,发酵液中纤维素酶和半纤维素酶的活性分别于菌株培养到第12h和48h达到最大,总糖和还原糖含量分别于4h和12h达到最高值,降解5d后麦麸的结晶度未发生明显变化。通过分析底物残渣的傅立叶红外光谱可知,此菌株对麦麸的降解以半纤维素为主。麦麸中木质纤维素的各主要成分纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为2.72%、25.61%和1.09%。利用扫描电镜观察麦麸降解5d后的残渣,可观察到,Bacillus sp.X10-1-2主要降解了底物内表面蜂巢结构的边缘骨架。     

自杀质粒同源重组技术敲除阴沟肠杆菌budC基因以提升乙偶姻的产率

为了研究阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,E.cloacae)SDM的2,3-丁二醇脱氢酶(budC)基因对乙偶姻产生的影响，采用自杀质粒同源重组技术敲除该基因。根据E.cloacae SDM的budC基因序列设计引物，构建budC基因敲除质粒，然后将质粒转化进E.cloacae SDM中，根据表型筛选及PCR验证获得budC基因缺失菌株。进行发酵试验后，利用高效液相色谱检测乙偶姻产量。结果表明，目的基因budC敲除成功，与原始菌株相比，基因缺失菌株2,3-丁二醇的产量降低了76.34%,乙偶姻的产量提高了103.78%。budC基因的敲除阻断了乙偶姻进一步分解代谢产生2,3-丁二醇的途径，提高了乙偶姻的产量。该试验获得了E.cloacaeΔbudC突变株，为利用微生物法工业化生产乙偶姻奠定了基础。     

合成2,3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌菌株的筛选及改造

2,3-丁二醇(2,3-BD)是具有广泛工业应用前景的平台化合物,可应用于医药、食品、航天、航空等诸多领域。近年来,随着石油资源的枯竭和人类生存环境不断恶化,人们保护环境的意识有所提高,因此,生物法合成2,3-丁二醇成为了国内外研究热点。但生物法合成2,3-丁二醇的效率问题一直制约着其工业化进程,采用代谢工程的理论及方法,优化及改造菌株代谢途径有望改变这一现状。肺炎克雷伯氏菌作为2,3-丁二醇的生产菌,具有较强的环境适应能力,并且其底物范围广、代谢彻底、副产物较少、转化率较高,是具有工业化生产前景的菌株之一。本文综述了近年来肺炎克雷伯氏菌及其他菌株合成2,3-丁二醇研究过程中的菌株改造及构建方法,这对于其他具有工业应用价值的菌株改造工作具有一定的借鉴意义。     

NTG和UV复合诱变选育紫杉醇高产菌株的研究

对紫杉醇产生菌HD1-3的孢予分别进行了紫外线照射(UV)、亚硝基胍(NTG)和UV NTG复合诱变处理,筛选制霉菌素抗性突变株.试验所确定的Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌HD1-3孢子诱变的适宜条件为:将孢子悬液经过3.0 mg·mL-1 NTG、处理20 min后,在电磁搅拌下,用紫外灯(30 w,距离30 cm)照射处理45 s.共筛选出17株正突变株.经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的诱变菌株——UN25-3,其紫杉醇产量从出发菌株的(232.73±4.61) μg·L-1提高至(327.14±7.63) μg·L-1.     

λRed技术构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶基因缺失突变株

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶(acetate kinase,ack)是乙酸生成途径中的关键酶,敲除ack基因,理论上可以阻断乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本文利用λRed技术构建乙酸激酶基因敲除重组质粒p T-LKR,通过酶切、纯化获得线性片段ack L-Kanr-ackR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,卡那霉素抗性筛选阳性转化子。结果表明,经PCR及测序验证K.oxytoca HD79乙酸激酶缺失工程菌株构建成功,为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。     

一株产聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的嗜盐菌Halomonas sp.发酵条件的优化及产物特性鉴定

对一株合成聚-β-羟基脂肪酸酯(PHB)的Halomonas DQ-4发酵过程中碳、碳氮比、温度、pH值、转速及装液量等条件因子进行了优化。结果表明,最佳发酵条件为:碳源为葡萄糖,碳氮比为100/7,生长温度38℃,pH值为9,转速为160 r·min~(-1),装液量为100 m L/500 m L,连续培养60 h时,PHB产量达到峰值,为5.88 g·L~(-1)。同时,对发酵合成的PHB进行了核磁共振氢谱、红外光谱的表征,热重分析表明,PHB具有良好的热稳定性,并且在降解实验中表现了优良的生物降解性。     

地瓜加工副产物生产工业酒精的关键工艺研究

采用地瓜加工后的副产物—地瓜皮、地瓜头尾等含淀粉新鲜下脚料,通过淀粉酶、糖化酶和纤维素酶降解后,接种热带假丝酵母和酿酒酵母混合菌株进行生料发酵,生产工业酒精,通过正交实验对影响其发酵的9个关键工艺参数进行优化研究并进行LSD（Least-Significant Difference）多重比较,结果表明：最优发酵工艺条件为淀粉酶用量0.8‰、糖化酶用量1.0‰、纤维素酶用量0.3‰、原料料水比1：2.5、酵母菌株比例1：1、酵母菌株接种量7.5%、发酵温度30℃、pH值6.5、发酵时间8d.在此条件下,酒精的产量为0.2502g乙醇/g干料,产品质量符合GB/T 394.1-2008粗酒精标准.     

木质素降解菌株产木质素降解酶的研究

采用液体静止培养,通过对分离筛选获得的两株高效木质素降解菌株15 -1和14 -7的发酵产木质素酶条件进行优化,得出结论:两株菌的最佳碳源均为稻草,最佳氮源均为尿素,最佳温度均为30℃.在最佳培养条件下进行发酵产酶,测得14 -7的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶活力分别为0.350 U· mL-1和0.080 U· mL...     

一株木质素降解菌的筛选、鉴定及其漆酶发酵条件的优化

采用愈创木酚-PDA平板显色、Azure-B蓝色平板脱色初筛,摇瓶发酵复筛,从腐木中筛选到木质素酶高活性菌株Lys3002.经ITS测序分析和形态观察,Lys3002鉴定为毛栓菌(Trameteshirsuta).采用液体摇瓶优化发酵条件,结果表明:野生型菌株Lys3002的木质素酶系中漆酶的最适发酵条件是:麸皮20g/L,豆饼粉6g/L,培养基初始pH6.0,MgSO4·7H2O0.5g/L,CuSO4·5H2O0.05g/L,MnSO40.05g/L,培养温度30℃,发酵周期5d,漆酶活力高达597.82U/L,具有深入研究价值和应用潜力.     

产脂肪酶菌株的分离、鉴定及其产酶条件优化

从长沙岳麓山和湘江等地富含油脂的样品中分离得到一株产脂肪酶菌株CS 1-1,经18S rDNA序列分析,确定该菌株为黑曲霉(Aspergillus,niger).对该菌株的产酶条件进行优化,发现该菌株在以体积分数为1%的橄榄油为诱导物,5 g/L蔗糖为碳源,40 g/L蛋白胨为有机氮源,1 g/L(NH4)2SO4为无机氮源,pH为6.5的培养基中,于28℃,180 r/min摇床培养48 h,可达最大酶产量(37.6±0.8)mmol·min-1·L-1.     

降解大豆甾醇微生物菌株的诱变研究

采用紫外线照射、NTG、5-BU等化学诱变剂或二者结合复合诱变处理对大豆甾醇有较强降解能力的野生型节杆菌A-6，得到对雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）分解酶缺陷型菌株，实验结果表明：诱变菌株可使大豆甾醇的转化率达95%以上，ADD产率达45%左右。     

人工神经网络耦合遗传算法优化细菌纤维素发酵培养基

细菌纤维素作为新型生物材料,已成为生物材料研究热点,但产量低限制了其进一步应用。选择合适的优化策略是实现产量提高的一个重要方法。本文在正交和均匀设计实验传统建模方法的基础上,运用人工神经网络模型结合遗传算法优化汉氏葡糖醋杆菌(Komagataeibacter hansenii HDM1-3)产细菌纤维素发酵培养基。结果表明,最佳培养基配方为葡萄糖3.98%、牛肉膏0.34%、酵母膏0.19%、磷酸氢二钠0.22%、磷酸氢二钾0.46%、乙醇2.23%。在此配方下,细菌纤维素产量最高达到2.87 g·L~(-1),与优化前培养基的产量相比提高了1.18倍。本研究优化了细菌纤维素发酵培养基参数,为细菌纤维素高产发酵及工业化推广应用提供了依据。     

木聚糖酶产生菌固体发酵条件的初步研究

木聚糖酶产生菌 (Aspergillusniger) 1 - 1 3菌株以白酒丢糟作为碳源进行固体发酵生产木聚糖酶 .采用单因素搜索对其最适产酶的氮源和发酵条件进行优化 ,结果表明 :添加的最适氮源为硫酸铵 ,最适加入量为 1 6% (以白酒糟干质量计 ) ;最适产酶发酵条件 :温度为 30℃ ,初始含水量为 5 5 % ,接种量为 1mL菌悬液 (浓度为 7× 1 0 7个 /mL)接种到 1 0 g固体培养基中 .在此优化条件下培养 72h ,木聚糖酶活力可达最高为 370IU/ g酒糟粉     

深黄被孢霉的化学诱变

以深黄被孢霉为出发菌,通过硫酸二乙酯（DES）诱变,获得优化的变异菌株XM－1,经初筛、复筛及传代实验,表明其是稳定的变异株,变异株XM－1在28℃下,发酵120h后,菌体生物量为15．1g/L,油脂量为7．5g/L,与原始菌相比,生物量、油脂量分别提高了43．8％和47％。     

一株高效稻草纤维素降解真菌的筛选与鉴定

采用刚果红羧甲基纤维素钠培养基法、滤纸条降解法和胞外酶活性测定法从长白山原始森林的腐烂枯木和落叶腐质土中筛选一株高产纤维素酶的真菌,结合菌落形态学和分子生物学方法鉴定该菌株为产黄青霉,命名为CBS-1.滤纸崩解实验说明在24h该菌对滤纸就具有明显的崩解能力,6d后滤纸的失重率达到24.1％;以稻草粉为底物发酵120 h...     

产纤溶酶菌株根霉12#的诱变育种

以产纤溶酶的华根霉12＃为出发菌株,对其进行紫外线-氯化锂复合诱变,筛选到74株制霉素抗性突变株。所有抗性突变株经进一步固体发酵筛选,获得了4株稳定高产纤溶酶的正突变株,其纤溶酶产量分别比出发菌株提高32.9%、21.5%、22.3%和18.0%。     

菌种发酵歧化甘油产1,3-PDO条件研究

以甘油为原料,通过单因素实验对菌株间歇发酵法生产1,3-丙二醇的生产条件进行了研究.结果表明:最适的甘油含量为40g/L,最适氮源为(NH4)2HPO4,用量为3g/L,pH 7.5,温度为30℃,装液量为40%,摇床转速为100r/min,发酵时间为24h.在最佳培养基组成与最佳发酵条件下发酵了3批,最终的1,3-PDO浓度平均值为23.2g/L,甘油的摩尔转化率为70.2%,比优化前的60.5%提高了9.7%.     

二乙烯基三胺基氧化纤维素的合成及对尿酸和砷(Ⅲ)的吸附性能

将2,3-二醛基氧化纤维素的6位羟基先用二氯亚砜氯化,然后多胺化反应制备二乙烯基三胺基氧化纤维素(YXA2.3).对其进行了元素分析、IR光谱分析和光电子能谱检测,并在透析液和纯水中对尿酸和砷(Ⅲ)分别进行了吸附实验.结果表明,在纯水中,当尿酸浓度为1.0 mg·L-1、吸附温度为37℃、透析液pH值为7,动态吸附实验在8 h时达到吸附平衡,平衡时吸附容量为20.5 mg·g-1;当砷(Ⅲ)浓度为20.0μg·mL-1透析液时,动态吸附实验均在8 h达到吸附平衡,平衡时吸附容量分别为411.0 μg·g-1.由此可知所研制二乙烯基三胺基氧化纤维素具有分别吸附尿酸和三价砷的功能.     

菌种发酵歧化甘油产1,3 PDO条件研究

以甘油为原料,通过单因素实验对菌株间歇发酵法生产1,3 丙二醇的生产条件进行了研究.结果表明：最适的甘油含量为40 g/L,最适氮源为(NH4)2HPO4,用量为3 g/L,pH 7.5,温度为30 ℃,装液量为40%,摇床转速为100 r/min,发酵时间为24 h.在最佳培养基组成与最佳发酵条件下发酵了3批,最终的1,3 PDO浓度平均值为23.2 g/L,甘油的摩尔转化率为70.2%,比优化前的60.5%提高了9.7%.