大鼠中性氨基酸转运蛋白SNAT1-HA融合蛋白的构建和表达(英文)

Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1是一种膜蛋白,属于转运蛋白第38家族(SLC38),在中枢神经系统(CNS)中起到重要的生理学作用.为了更容易地检测SNAT1在细胞膜上的表达,以pBK-CMVΔ-SNAT1为模板,用PCR,双酶切和T4连接酶连接的方法在SNAT1的C端加上了一个HA标签蛋白,构建了一个新质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA.用该质粒瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染36 h以后,融合蛋白SNAT1-HA可以用HA抗体检测.Western blot结果显示在约54 kDa处有一条特异性条带,与预期分子量大小一致.利用重组质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA可以更方便地检测到SNAT1在细胞膜上的表达与定位,为进一步研究SNAT1结构与功能奠定了基础.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白SNAT1-HA融合蛋白的构建和表达(英

Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1是一种膜蛋白,属于转运 蛋白第38家族(SLC38),在中枢神经系统(CNS)中起到重要的生理学作 用.为了更容易地检测SNAT1在细胞膜上的表达,以pBK-CMVΔ-SNAT1 为模板,用PCR,双酶切和T4连接酶连接的方法在SNAT1的C端加上了一 个HA标签蛋白,构建了一个新质粒pBK-CMVΔ-SNAT1-HA.用该质粒瞬 时转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染36 h以后,融合蛋白SNAT1-HA可 以用HA抗体检测.Western blo     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.     

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2-HA融合蛋白的构建及鉴定

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT2在哺乳动物组织中广泛表达,具有转运中性氨基酸的功能,在谷氨酸-谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．为了方便测定SNAT2在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接将HA标签蛋白与SNAT2的C末端连接,构建了真核生物表达载体pBK-CMVA（1098—1300）-SNAT2-HA表达载体．用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染到HEK293T细胞中,通过Westernblot法检测到SNAT2-HA融合蛋白在细胞膜上的正确表达和定位．pBK-CMV△（1098-1300）-SNAT2-HA表达载体的成功构建,为今后对SNAT2的结构和功能的研究提供了有效方法．     

膜片钳全细胞记录法在研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制中的应用

为了研究中性氨基酸转运蛋白-谷氨酰胺转运蛋白的结构与功能,采用膜片钳全细胞记录法测定谷氨酰胺转运蛋白2介导的电流.结果表明:谷氨酰胺转运蛋白诱导了底物氨基酸和Na+浓度依赖性电流,可用于测定底物氨基酸和Na+对转运蛋白的表观亲和常数Km,SNAT2野生型对丙氨酸的表现亲和常数KmAla为(200±5)×10-6mol/L,对Na+的表观亲和常数KmNa为(100±7)×10-3mol/L.谷氨酸转运蛋白转运底物氨基酸过程是生电的过程,在膜电势负值时氨基酸转运电流增大,可用于转运机制的研究.因此膜片钳全细胞记录法是研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制的有效方法.     

Rab39A多克隆抗体的制备与鉴定

制备抗人Rab39A多克隆抗体并进行纯化检测,以用于Rab39A功能的研究.选取免疫原性强且特异性高的羧基端42个氨基酸(176～217aa)作为目的片段.PCR法扩增并构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rab39C42.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化GST-Rab39C42融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体.然后以亲和层析法纯化抗体,利用Western blot和免疫荧光检测抗体的特异性.结果表明,构建的原核表达载体经IPTG诱导后高效表达GST-Rab39C42蛋白,纯化后抗体质量浓度为1μg/μL;Western blot实验显示,抗体可以识别外源Rab39A蛋白和多个细胞系的内源Rab39A蛋白;抗体中和实验和RNA干扰实验证明了该抗体具有特异性.本研究成功构建了pGEX-4T-1-Rab39C42原核表达载体,并制备了特异性的抗人Rab39A兔多克隆抗体,为进一步研究Rab39A的功能提供了有力的支持.     

大鼠中性氨基酸转运蛋白HA-SNAT3融合蛋白的构建和鉴定(英文)

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白SNAT3是SLC38基因家族N系统的成员之一,主要在脑部和视网膜的星形胶质细胞中表达,负责转运谷氨酰胺,在脑部和肝脏的谷氨酸-谷氨酰胺循环中发挥重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达和定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接的方法将HA标签连接到质粒pBK-CMVΔ(1098-1300)-SNAT3中大鼠SNAT3的N端,构建了真核生物表达载体pBK-CMVΔ-SNAT3.用脂质体转染法将该表达载体瞬时转染进人胚肾细胞(HEK293T cells),通过Western blotting检测HA-SNAT3融合蛋白的表达.结果表明,HA-SNAT3能够正确在细胞膜上表达.pBK-CMVΔ-SNAT3表达载体的成功构建对于进一步研究SNAT3的结构和功能提供了有效方法.     

N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N-糖酰胺酶F基因,经酶切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中,16℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化作用检测,结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.     

pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒载体构建及其表达鉴定

SNAT2是SLC38基因家族编码的Na＋偶联中性氨基酸转运蛋白中属于systemA的成员之一．它在谷氨酸一谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．增强型绿色荧光蛋白EGFP的连接对于SNAT2在细胞表达中的定位以及检测都有很大的帮助．采用PCR扩增和酶切技术将EGFP连接到质粒pBK-CMV△-SNAT2中SNAT2的N端．通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和测序验证得到pBK-CMV△-EGFP—SNAT2质粒载体,将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞（HEK293cells）用Westernblot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位．结果表明：EGFP．SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．pBK．CMV么．EGFP．SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义．     

重组SARS冠状病毒S蛋白的原核表达研究

目的克隆表达SARS冠状病毒的主要结构蛋白(S蛋白)。方法合成SARS冠状病毒S蛋白特异性基因片断并克隆入pET32a原核表达载体,转化BL21菌,经IPTG诱导高效表达得到重组S蛋白,并通过W estern印迹对重组蛋白质进行鉴定。结果重组蛋白质经镍柱亲和层析得到了部分纯化,免疫动物后得到SARS病毒的多克隆抗体。结论经E lisa检测,表达的重组S蛋白基本具备检测病人血清中抗SARS病毒IgG和IgM的能力,可进一步用于S蛋白功能研究与SARS诊断试剂盒的研制。     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

波纹唇鱼神经肽Y基因的克隆及原核表达

以波纹唇鱼为实验对象,采用同源基因克隆技术和RACE技术得到神经肽Y基因的cDNA全长序列.波纹唇鱼npy的cDNA全长序列为645 bp,包含59 bp的5'UTR、300 bp的ORF和286 bp的3'UTR.分子进化的比对分析表明,波纹唇鱼NPY前体与斜带石斑鱼和锯隆头鱼的亲缘关系最近.波纹唇鱼ORF编码99个氨基酸,NPY前体多肽包括:信号肽、成熟肽、Gly-Lys-Arg翻译后加工位点和羧基末端侧翼肽段(CPON).该NPY前体的预测分子质量为11.27 kD,理论等电点为5.51.采用pET-32a(+)原核表达系统构建波纹唇鱼npy基因的原核表达重组子pET-32a(+)-NPY,并获得重组菌株.对重组蛋白表达菌株进行培养条件优化,结果表明:该菌株在30℃,0.6 mmol/L IPTG,培养时间8 h的条件下,重组蛋白的表达效率最高.     

黄斑蓝子鱼CRH基因的克隆及其在浅水应激后的mRNA表达

鱼类应激时主要启动两种生理反应系统,即"交感-嗜铬组织"系统/和/或"下丘脑-垂体-肾间组织轴"(HPI轴)系统.在实际生产操作中,鱼类容易受到浅水暴露应激.为了探讨黄斑蓝子鱼在受到浅水应激后HPI轴是否被激活,本研究克隆了下丘脑中启动HPI轴活性的关键因子—促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的基因,并检测其在应激前和受到浅水应激后不同时间点(0、20、40、60、80 min)的mRNA水平.结果显示,CRH前体的cDNA全长为1025 bp,编码170个氨基酸(aa),分别由一个信号肽(24个aa)、一个功能未知保守区(13个aa)和一个成熟肽(41个aa)组成;该CRH前体和成熟肽与其他鱼类的相应肽分别具有62%-98%和78%-100%的序列相似性.当鱼体受到短暂(4 min)浅水应激后80 min内,脑中CRH mRNA水平在应激前后无显著变化(P>0.05),说明黄斑蓝子鱼在受到急性浅水应激后可能主要启动"交感-嗜铬组织"系统而不是HPI轴.     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

小鼠LEAP-2基因的克隆及其真核表达质粒的构建

从小鼠肝中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,获得了mLEAP-2基因编码区的cDNA,扩增出小鼠肝表达抗菌肽-2（mLEAP-2）成熟肽基因片段,重组入克隆载体pUCm-T,经DNA测序,该基因为120 bp,编码40个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建成表达载体pPIC9-LEAP-2。重组毕赤酵母表达载体pPIC9-LEAP-2的结构,可望获得超量表达的高活性肝表达抗菌肽-2,为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定基础。     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．