牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

 通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

斜带石斑鱼ERP44基因的克隆与表达分析

为进一步了解内质网蛋白44基因(ERP44)在石斑鱼免疫反应中的作用,本研究根据实验室石斑鱼转录组数据中ERP44的表达序列标签(EST)设计引物,克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)Ec-ERP44基因的开放阅读框序列(ORF),利用生物信息学手段分析Ec-ERP44基因及其编码蛋白的序列结构和特征,并通过实时荧光定量PCR检测该基因的组织分布特征,以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后该基因在石斑鱼脾脏中的表达变化。研究结果表明,Ec-ERP44基因ORF全长1 233 bp,编码410个氨基酸;该蛋白具有蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族保守的硫氧还蛋白结构域。同时,Ec-ERP44基因在健康石斑鱼体内的多种组织均有表达,其中在脑组织中的表达量最高;在LPS与Poly I:C刺激后,石斑鱼脾脏中Ec-ERP44基因的表达显著上调。本研究结果表明,Ec-ERP44基因参与了石斑鱼抗病原感染的免疫反应。     

日本鳗鲡γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因的克隆鉴定与表达分析

在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得2个γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因AjGILT-1和AjGILT-2,并对其序列进行生物信息学分析,进而利用实时荧光定量PCR分别检测2个基因在不同组织器官中的表达水平,及其在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达变化.结果显示:2个基因编码的蛋白序列中均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位点CXXC、2个糖基化位点和11个保守的半胱氨酸残基,基因组序列均含7个外显子和6个内含子.2个基因启动子中都存在多个转录因子结合位点,如γ-干扰素活化位点以及特化蛋白1结合位点;不同的是AjGILT-1启动子区存在多个核因子-1、激活蛋白-1结合位点及干扰素刺激反应元件,而在AjGILT-2启动子区未发现.AjGILT-1在鳃和肠中表达量最高,而AjGILT-2在性腺、头肾和脾脏中表达量最高;除肠道外,同一组织中AjGILT-2的表达量均高于AjGILT-1.LPS、PolyI:C刺激和E.tarda感染后,AjGILT-1与AjGILT-2的表达在鳃中仅有少数变化,而在头肾和中肾中则变化较明显.综上所述,AjGILT-1和AjGILT-2基因可能参与了日本鳗鲡受病毒和细菌感染后的免疫应答.     

斜带石斑鱼TLR5S基因结构及功能分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)属于先天免疫系统中的一种模式识别受体(PRR),可分为可溶型和跨膜型2种.它可以识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),从而启动信号转导.本研究从NCBI数据库中得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)可溶型TLR5(ECTLR5S)cDNA全长序列(Genbank登录号:GQ396667).其cDNA序列全长2 439bp,包括69bp的5′UTR,435bp的3′UTR和1 935bp的开放阅读框,共编码644个氨基酸,预测编码蛋白质分子质量为72.28ku,等电点为6.37.将ECTLR5S基因氨基酸序列与其他脊椎动物的TLR5S基因氨基酸序列进行比对,结果显示出很高的相似性,其中与牙鲆相似度可达69%.Real time PCR检测结果显示ECTLR5S基因在斜带石斑鱼不同器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,其次是脾脏、血淋巴、肾脏等.Realtime PCR检测ECTLR5S基因在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染3,6,12,24,48h后的肝脏中表达情况,结果显示ECTLR5S基因在3,6,12,24h时表达量显著上调(p<0.05),而在48h下降至初始水平.这些结果说明ECTLR5S基因可能参与到斜带石斑鱼抗弧菌感染的免疫反应中,并且肝脏是其发挥作用的重要器官.     

斜带石斑鱼Frizzled 4基因的克隆及表达分析

利用同源克隆和RACE的方法,从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)卵巢中克隆了Frizzled4(g FZD4)的全长c DNA序列.g FZD4的c DNA序列全长2 033bp,其中开放阅读框1 596bp、编码531个氨基酸.氨基酸序列比对和系统树分析显示,g FZD4的结构十分保守,斜带石斑鱼与鲈形目罗非鱼的亲缘关系最近.RT-PCR分析表明,g FZD4基因在斜带石斑鱼组织中广泛表达,其中脑、肾脏、心脏和腮组织的表达量较高.荧光定量PCR检测结果显示,g FZD4基因的表达水平在胚胎发育的早期较低、在桑葚期显著升高、在囊胚期最高,其后除了肌节形成期外均基本与桑葚期的表达水平相似;g FZD4基因在卵巢发育过程中表达水平较低,而在性逆转的精巢发育过程中表达水平显著升高,表明g FZD4介导的Wnt信号通路在石斑鱼的性逆转过程中可能发挥了重要作用.     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列.同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895).RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势.推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用.     

过表达has-miR-145对人恶性多发性畸胎瘤细胞增殖凋亡的影响

通过构建hsa-miR-145的重组体pGenesil-1-miR-145, 并瞬时转染到人恶性多发性畸胎瘤细胞(NTERA-2)后, 利用qRT-PCR法检测hsa-miR-145, 以及肿瘤发生相关基因OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, FSCN1在转录水平的表达差异;同时利用MTT法和流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染法检测hsa-miR-145对NTERA-2细胞增殖的生物学效应和细胞凋亡的影响. 结果表明:hsa-miR-145的高表达导致NTERA2细胞增殖明显减弱, 凋亡率增加;转染重组质粒hsa-miR-145后, OCT4, SOX2, c-Myc, FSCN1基因的表达量均有所降低, 提示miR-145的过表达可能通过抑制靶基因的表达从而影响生殖肿瘤细胞的生物学功能.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

TGFβ1 shRNA对293细胞合成TGFβ1的干扰作用

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对293细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗方法提供技术基础和依据.方法:针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1 shRNA和TCFβ1基因的绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空质粒组为对照,通过脂质体包裹分别转染293细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TGFβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后293细胞TGFβ1mRNA表达量,转染后24、48和72 h TCFβ1shRNA质粒组TCFβ1mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.2%、97.1%和67.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染293细胞后24、48和72 h TGFβ1shRNA均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

尼罗罗非鱼TNF-R1和TNF-R2基因克隆及表达

为揭示TNF-α受体基因TNF-R1和TNF-R2在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫过程的作用,本研究利用RACE技术获得了TNF-R1和TNF-R2的cDNA。结果表明,TNF-R1 cDNA全长2 275 bp,ORF区1 335bp,编码444个氨基酸;TNF-R2 cDNA全长1 719 bp,ORF区1 476 bp,编码491个氨基酸。TNF-R1含3个富含半胱氨酸结构域(cysteine-rich domain, CRD)和一个死亡结构域(death domain,DD),而TNF-R2有4个CRD,缺少DD。系统进化分析表明:其TNF-R1和TNF-R2分别与其他脊椎动物TNF-R1和TNF-R2基因同源性很高,在进化树中TNF-R1、TNF-R2各自聚类且两者之间分支明显。实时荧光定量PCR结果表明:TNF-R1和TNF-R2在该鱼体的不同组织中均有表达,其中在鳃、头肾和脾脏中表达水平最高,而在肌肉、垂体中表达量低。用脂多糖(LPS)和多聚肌苷酸-胞苷酸(PolyⅠ:C)分别刺激离体孵育的该鱼头肾和脾脏白细胞可不同程度上调TNF-α、TNF-R1和TNF-R2的表达。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染该鱼可显著上调头肾和脾脏中3种基因的表达。本研究对揭示TNF-R1和TNF-R2免疫调控机制,提高罗非鱼健康养殖水平具有一定参考价值。     

NaCl和Na2CO3胁迫下的高粱MAPKs基因家族表达模式

通过在全基因组水平上进行NaCl和Na2CO3胁迫下高粱MAPKs基因表达模式的研究, 探索高粱MAPKs基因在胁迫条件下参与信号传导的机理. 结果
表明, 从高粱基因组中鉴定出16个MAPKs基因, 命名为SbMPKs. 这些SbMPKs在NaCl和Na2CO3胁迫下的表达模式明显不同, 表明中性盐胁迫诱导的信号响应不同于碱性盐. 在NaCl胁迫下, 除了SbMPK13的表达量在12 h时达到最大值外, 所有高粱MAPKs基因在24 h内表达持续上调; 在Na2CO3胁迫下, 只有SbMPK3,SbMPK10和SbMPK13表达上调, 表明这3个基因可能与高粱碱性盐胁迫应答反应有关. 系统发育分析表明, SbMPK13属于C组MAPKs基因, 并且与水稻中受脱落酸（ABA）和盐胁迫诱导表达的OsMAPK2亲缘关系较近, 进一步证实了SbMPK13可能是参与高粱盐胁迫应答的重要调控基因.     

籼稻姊妹染色单体粘着蛋白OsRad21-i基因的原核表达载体构建与表达

 以杂交水稻汕优63的根组织cDNA为模板,采用引物设计引入酶切位点和RT-PCR方法,扩增出了籼稻姊妹染色单体粘着基因OsRad21-i (AY318757)开放阅读框（ORF）,命名为Eqfr,两端分别带有BamHⅠ和SalⅠ限制性位点。然后克隆到pGEM-T载体,将重组克隆载体pGEM-T-Eqfr与表达载体pQE30分别同时进行BamHⅠ和SalⅠ双酶切,连接酶切后的Eqfr和pQE30,并转化DH5α感受态细胞,获得了DH5α［pQE30-Eqfr］重组克隆。再以其重组质粒转化M15［pREP-4］感受态细胞,筛选出M15［pQE30-Eqfr, pREP-4］重组克隆。通过诱导表达,检测到了相对分子质量约为116 000的重组蛋白表达,在诱导后的1～3 h里表达量较高,之后表达量开始下降。用实验证实了理论推测ORF的正确性,所获得的表达蛋白及其表达体系为下一步的蛋白质实验奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnFAD8基因编码序列的克隆和表达谱分析

通过比对拟南芥等同源基因,克隆了甘蓝型油菜FAD8基因中的保守序列.以得到的FAD8（Fatty Acid Desaturase 8）保守序列片段为信息探针,在GenBank的EST数据库中检索高度同源的EST,并通过人工拼接及RTPCR得到油菜该基因的全长为1299 bp的cDNA序列,命名为BnFAD8.序列分析结果中发现该基因符合质体定位的ω3脂肪酸脱饱和酶序列特征.通过比较22 ℃和8 ℃处理的甘蓝型油菜的BnFAD8基因表达谱,发现该基因在常温下仅存在痕量表达;而在低温条件下在叶中表达出现     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

鲤鱼NOD1基因克隆与组织特异性表达分析

利用RT-PCR技术在鲤鱼(Cyprinus carpio)中首次克隆得到了NOD1基因编码序列全长。生物信息学分析发现,鲤鱼NOD1具有3个保守结构域和相应的保守位点,在进化中与草鱼亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析NOD1基因在鲤鱼不同组织中分布发现,NOD1在头肾和血液中表达最高,在肌肉、皮肤和性腺中表达量最少;鳗弧菌(V.anguillarum)刺激后NOD1基因在肝脏、脾脏、头肾和前肠中表达量都有明显上升。研究结果显示NOD1在鲤鱼应对鳗弧菌刺激天然免疫过程中可能发挥着重要作用。     

类胰岛素生长因子(IGFs)在斜带石斑鱼胚胎及卵巢的表达

生殖和生长是生物体最基本的特征,两者既密切相关又相互区别,IGFs是生长轴和生殖轴相交联的关键因子。自IGFs在鱼类卵巢的表达被发现后,它们在卵巢的功能开始备受关注,大量的研究表明它们参与了鱼类的性腺发育和成熟进程。氨基酸序列同源性比对表明:IGF-3具有IGF家族成员典型的结构特征,相对IGF-1和IGF-2基因的高保守性,IGF-3基因保守性差。本研究用半定量和荧光定量PCR技术检测了IGF-1、IGF-2和IGF-3 mRNA在斜带石斑鱼胚胎发育及人工诱导性逆转过程中的表达模式。对胚胎发育的半定量结果显示:IGF-1在斜带石斑鱼胚胎发育过程中仅有微弱表达,IGF-2自桑椹期开始表达,在桑椹期后期呈现持续高水平的表达态势,预示IGF-2对胚胎发育有着重要作用;IGF-3自未受精卵开始,随着胚胎发育表达水平不断提高,但表达量不如IGF-2丰富,暗示了IGF-3可能在胚胎发育进程中扮演某种角色。利用甲基睾丸酮MT埋植鱼体腹腔,诱导性逆转,荧光定量PCR结果显示:IGF-1和IGF-3在斜带石斑鱼性逆转过程中的表达量都显著性降低,而IGF-2却没有显著变化,表明不同IGFs因子在雌性和雄性的生理功能存在性别差异。     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.