斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析

基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

赤点石斑鱼ICLP基因的克隆和序列分析

MHC class II invariant chain-like proteins(ICLP)因子与免疫反应密切相关,其参与对抗原的处理,保证多肽不被进一步降解为氨基酸.通过RACE反应获得赤点石斑鱼ICLP2cDNA全序列,全长1 837 bp,包括44 bp的5′UTR区,861 bp的开放阅读框以及932 bp的3′UTR区.编码286个氨基酸,推测的蛋白质分子量为31 878 u.对赤点石斑鱼10个组织的ICLP2基因进行PCR扩增和测序,结果表明赤点石斑鱼ICLP2基因的表达不存在组织特异性.此外,氨基酸序列同源比对的结果表明,赤点石斑鱼与其它16种脊椎动物ICLP2的相似度在25%～78%之间,与狼鲈和鳜鱼ICLP2因子的同源程度最高,分别为78%和74%.根据ICLP的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树,表明了该分子的氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好指标.     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

青蛤(Cyclina sinensis)亲环素A基因的克隆与鳗弧菌刺激后的表达分析

采用SMART-cDNA文库和高通量测序方法,筛选出青蛤亲环素A基因(CypA)的全长cDNA.采用荧光定量PCR法分析该基因在鳗弧菌刺激后的表达情况,并对青蛤Cyp A基因进行原核表达与蛋白纯化.结果表明,青蛤CypA基因全长共962 bp,其中5′UTR为87 bp,3′UTR为346 bp,开放阅读框长度为495 bp,可以编码164个氨基酸,理论相对分子质量约为19.39 kDa,等电点约为5.25.在菌液侵染刺激条件下,刺激3 h后表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.本研究成功表达了重组CypA蛋白,并运用镍离子交换柱法分离纯化出该蛋白,其相对分子质量约为19 kDa.     

赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析

采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1 680bp,含有3′UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5′UTR区,编码区大小为1 074～1 080bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHC IA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC IIB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.     

斜带石斑鱼转化生长因子β1（TGF β1）基因的克隆及表达分析

  转化生长因子β1（TGF β1）是一种高度保守的多效细胞因子。通过分子克隆得到了斜带石斑鱼Epinephelus coioidesTGF β1 cDNA全长序列,全长为2 477 bp,开放阅读框为1 161 bp,编码一种含386个氨基酸的多肽。Realtime PCR分析表明,TGF β1基因在健康斜带石斑鱼所取组织中均有表达,肾脏中表达最高,其次是头肾和脾脏。用PolyI:C或ConA刺激斜带石斑鱼头肾淋巴细胞,TGF β1表达量明显上升,且在刺激4 h后达到最高值。用PolyI:C刺激16、24 h后,TGF β1几乎不表达,而用ConA刺激实验组,TGF β1表达量一直高于对照组。结果说明,斜带石斑鱼TGF β1基因结构和表达特征与其他硬骨鱼类具有高度相似性。