禽传染性支气管炎病毒H52反向遗传株的构建

IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3~2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3′片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see′m技术在每个片段中引入BsaⅠ或BsmBⅠ酶切位点,D1片段中引入沉默突变位点,在5′UTR端和N-3′引入T7启动子,3′UTR端引入Poly(A)尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3′体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.     

恒河猴植入位点差异基因筛选及蛋白激酶H11的克隆

采用cap-finder全长cDNA扩增技术和抑制消减杂交(SSH)相结合的方法研究了恒河猴胚胎植入初始时期子宫内膜植入位点与非植入位点的基因表达差异情况.在准确获取妊娠9.5 d恒河猴植入位点和非植入位点子宫内膜后,用SSH建立了植入位点消减cDNA文库,从中随机挑选了1440个克隆,通过点杂交获得了179个在植入位点高表达的克隆,经测序和与基因库(Gen-Bank/EMBL)比对分析,证实其中102个克隆对应于人或恒河猴的52个同源基因,75个克隆对应于人的58个EST,另外2个克隆没有找到对应的同源基因,推测为新的基因.对其中最高频率出现的差异表达基因-蛋白激酶H11,通过cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆得到了它的全长cDNA序列.与人的蛋白激酶H11相比,cDNA序列同源性达到94%,所编码的蛋白质序列同源性为83%     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列。设计了一对引物并以RT-PCR特异性扩增出IBV H52疫苗株的S1基因，基因产物大小为1．62kb，与设计相符，对其进行序列测定后，与其他标准毒株H120，M4l，BEAU株的S1基因进行同源性比较，结果表明，H52株与H120，M41和BEAU株的核苷酸序列的同源性分别为91．1％，96．9％和96．8％，由此可以看出，IBVH52疫苗株与标准毒株在Sl基因上具有高度的同源性。     

牛结核分支杆菌临床分离株rpsL，rpoB，KatG基因突变分析

采用噬菌体生物扩增法对本实验室分离鉴定的25株奶牛结核分支杆菌进行药敏分析,检测出14株耐链霉素、利福平、异烟肼菌株．用PCR扩增耐药株的rpsL基因片段（370bp）、rpoB基因片段（213bp）和KatG基因片段（458bp）,并对目的片段进行测序分析,其中5株耐链霉素菌株的rpsL基因在43位点发生突变,均由赖氨酸密码子（AAG）突变为精氨酸密码子（AGG）;5株利福平耐药株的rpoB基因在531位点、526位点、5¨位点发生突变,其中有3株分离株的rpoB基因在531位点发生点突变,1株分离株的rpoB基因在526位点发生突变,1株分离株的rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变．     

禽流感病毒番鸭分离株HA基因的克隆及序列分析

禽流感病毒番鸭分离株ZM（A／Muscovy/Zhejiang/1/2000)经12日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组RNA,采用RT－PCR方法一次性扩增出17kb的特异性条带,与预计大小相符,将扩增产物提纯后克隆pGEM-T载体,酶切分析筛选到含1．7kb基因片段的阳性质粒,进一步对该片段进行测定及分析,结果表明：所扩增的基因延期长度为1732bp,含HA基因完整的阅读框架,编码568个氨基酸,同源性分析表明：该毒株起源于欧亚种系,与GD／96的HA基因核苷酸同源率高达99％,表明这两个株HA基因亲缘关系极为密切。     

酒色着色菌Chromatium vinosum膜结合态氢酶基因hupSL的克隆及分析

光合细菌酒色着色菌(Chromatiumvinosum)含有Hup膜结合态氢酶.根据同科的桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)Hup氢酶同源序列,在结构基因小亚基hups和hupC的保守框上设计1对简并引物:Ps:5’CCGACCAC(C/G)TACAACGCCTG3’和Pc:5’CG(G/C)GACATGATGTC(T/C)TCGCG3’.通过PCR扩增获得2.6kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含部分的小亚基hupS序列、大亚基hupL的全序列及hupC部分序列.从已知的hupS序列选取适当位点合成引物AS2:5’CTACGACCATGTCACCGACA3’,并利用接头寡核苷酸序列P6:5’CCTTGTGAAATTGTTATCCGCT3’,通过PCR扩增获得1.2kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含完整的膜结合态氢酶的小亚基基因hupS.     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

辣椒脉斑驳病毒侵染性克隆构建的简易方法

本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus , ChiVMV)侵染性克隆的简易方法. 基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列, 根据基因内部的单一限制性酶切位点, 设计引物, 将ChiVMV分成KL1,KL2, KL3三个片段通过RT PCR和TA克隆的方法将3个片段构建到PMD19 T载体上. 通过双酶切将ChiVMV前面7000bp的片段构建到载体上, 从而将全部的ChiVMV cDNA分段构建到两个重组质粒中, 成功地避免了全长病毒序列在大肠杆菌中不稳定的现象. 进行体外转录时, 先通过PCR扩增出两个彼此有一定重叠的平末端片段, 再利用两个重叠片段为模板用重叠PCR的方法扩增出全长带T7启动子的ChiVMV cDNA, 并通过T7 RNA聚合酶成功转录出ChiVMV的病毒RNA.     

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.     

胡萝卜LEA基因家族新成员DcLEA1的克隆及其结构与表达特性分析

利用改进的cDNA代表性差示分析(RDA)技术,从调控状态的胡萝卜体细胞胚中分离到LEA基因片段,以该片段为探针筛选调控状态的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库及用控渗法构建的基因组文库,获得了胡萝卜LEA基因家族的一个新成员DcLEA1(GenBank注册号:AF308739).该基因转录区由5′UTR区、两个外显子、一个内含子及3′UTR构成,启动区长1.2kb;开放阅读框为480 bp,编码159个氨基酸和一个终止密码子.Northern杂交分析表明,DcLEA1基因在胡萝卜成体中无表达活性;在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有高表达活性;在解调控12 h的胡萝卜体细胞胚中,转录本含量急剧下降;随着解调控时间的延长,胡萝卜体细胞胚根开始延伸,DcLEA1基因的表达活性又有所增加.这一现象与LEA基因在种子休眠和萌发过程中表达活性的变化规律相似.由此推测,可以利用胡萝卜体细胞胚蔗糖调控-解调控体系,来模拟种子休眠与萌发的过程,研究植物胚根发育相关基因表达调控的分子机理.     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利与马杜霉素耐药株的3种同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对柔嫩艾美耳球虫(E imeria tenella)药物敏感株、地克珠利耐药株、马杜霉素耐药株以及2个耐药株重组体的乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸葡萄糖异构酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)同工酶进行了分析.结果显示:在LDH同工酶谱中,敏感株有一条浓带,3株耐药株均没有酶带;在GPI同工酶谱中,敏感株有4条带,地克珠利耐药株有GPI-2和GPI-4,而马杜霉素耐药株和重组体均含有GPI-2、GPI-3和GPI-4;在G6PD同工酶谱中,敏感株有4条带,而3株耐药株均只有G6PD-3和G6PD-4.同工酶分析表明,药物敏感株与3株耐药株之间的3种同工酶均有差异.3株耐药株之间的GPI存在差异,而在LDH和G6PD无差异.     

腺苷负荷二维应变评价冠心病患者左室整体应变及应变率

目的:探讨腺苷负荷结合二维应变超声心动图(two-dimensional strain echocardiography,2DSE)对冠心病患者左室整体应变及应变率的应用价值.方法:共入选15例经冠脉造影证实的冠心病患者,分别静脉注射腺苷注射液[140 μg· (kg· min)-1],用药时间6 min(总剂量为0.8 mg/kg).分别于腺苷注射液给药开始、给药后3min、终止给药时和停药后5min完成左心室短轴及长轴各切面的二维图像采集.应用Echo-PAC超声工作站分析左室心肌整体应变和应变率,比较腺苷负荷前(n=15)和负荷峰值剂量(n=15)左室短轴及长轴各切面心肌整体应变的改变.结果:与负荷前比较,负荷峰值下左室各切面心肌整体收缩期应变(GS)、收缩期应变率( GSRs)低于负荷前,舒张早期应变率(GSRe)、舒张晚期应变率(GSRa)、GSRe/GSRa比值则高于负荷前.除外GSRe/GSRa比值,其余各应变值差异均有统计学意义(P＜0.05)；组间各时间段两两比较,左室整体应变值差异有显著性意义(P＜0.01)；组内各切面间两两比较,应变值差异不明显(P＞0.05).试验中不良反应发生率为86.0％,但症状轻微,腺苷负荷试验安全性良好.结论:腺苷负荷超声心动图结合心肌二维应变可定量分析心肌运动规律,可为临床评价心功能提供有效的量化手段.     

植酸酶高产菌株的选育

从土壤中分离到1株植酸酶高产菌株Pe0,初步鉴定为米曲霉.为了提高植酸酶活力,对Pe0菌株分别进行紫外线和亚硝基胍诱变处理,经初筛、复筛、遗传稳定性能检测,得到1株酶活相对较高、性状相对稳定的菌株Pe2#,酶活稳定在10.66U/mL,较原始菌株提高到3.34倍.另对其发酵条件进行优化,确定最适接种量为4%,最适pH为5.5,最适培养时间为6.5d.在此基础上进行培养基正交优化,结果表明:葡萄糖质量浓度为25g/L,蛋白胨质量浓度为4g/L,(NH4)2SO4质量浓度为2g/L,MgSO4.7H2O质量浓度为0.1g/L时所得菌株产酶活力最高.     

苯酚降解菌的分离及其降解特性研究

从活性污泥中经定向驯化、分离纯化得到一株能以苯酚为唯一碳源生长的降解菌P1,通过革兰氏染色和一系列生理生化实验,初步鉴定其为微球菌属。研究菌株接种量、培养基初始pH值、培养温度、摇床转速、金属离子等因素对菌株P1的苯酚降解特性的影响。结果表明,苯酚降解适宜条件为:初始pH值7.0、温度35℃、转速150r/min、接种量3%,在此培养条件下,菌株P1可将500mg/L的苯酚于12h内完全降解;当苯酚的初始浓度为100~500mg/L时,菌株P1对苯酚的降解满足Monod零级反应动力学模型。     

基于应变梯度理论的假设应变有限元方法

采用基于应变梯度理论的假设应变有限元方法研究了微尺度梁弯曲的尺寸效应.在假设应变单元设计中,非局部的应变梯度项通过围绕高斯点的胞元进行数值积分得到.在本构方程中引入等效应变梯度项,在积分本构方程时就可以反映材料在微细变形时的尺寸效应.为了验证本方法的正确性,对微尺度下的悬臂梁进行了模拟计算.计算结果与已发表的实验结果比较吻合,表明可以模拟出材料微细变形的尺寸效应,具有较好的计算精度.     

高温应变栅丝蠕变对应变测量精度影响与补偿

接触式应变测量是材料和构件高温力学行为研究的必要手段,其测量精度是高温应变测量领域关注的热点,而应变栅丝的高温蠕变性能是测量精度的主要影响因素.本文首先根据材料蠕变机理分析应变片的蠕变特性,搭建高温应变栅丝蠕变电测的系统,基于诺顿蠕变规律与试验的测量结果,建立应变栅丝的高温蠕变模型.论文基于应变栅丝蠕变输出有限元模型,对栅丝蠕变输出的影响因素进行研究;最后建立了高温应变蠕变补偿模型,以提高高温应变测量精度,并取得了试验验证.     

耐盐酵母菌株的选育

通过紫外线和紫外线＋亚硝酸复合诱变方法，筛选出一株具较高耐盐性能的酵母菌，其耐盐性能由130g/L提高到240g/L，耐盐度提高了84.6%。     

关于杆件组合变形的应变能

在线弹性、小变形等基本假设条件下，由于杆件应变能与外作用力不成线性关系，所以杆件组合变形的应变能能否表示为各相应基本变形的应变能之和是个值得讨论的问题。本文从双向弯曲、拉弯、扭弯等组合变形方面详细推导了应变能公式，得出组合应变能为各基本应变能之和。