结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1.将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆.阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因.用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定.结果成功扩增了Der p2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功.说明成功地构建了胞壁表达Der p2-PEB1融合蛋白重组BCG pCW-Der p2-PEB1-rBCG.为基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

屎肠球菌hyl基因突变株的构建

目的：构建屎肠球菌类透明质酸酶（hyaluronidase,hyl）基因突变株,研究hyl基因的功能。方法：用pETX4577质粒构建屎肠球菌hyl基因重组自杀质粒,通过体内同源重组,筛选获得hyl基因的突变株,体外研究hyl基因缺失对突变株生长能力的影响。结果：经同源重组,利用卡那霉素抗性筛选,PCR、脉冲场电泳和southern blot进行鉴定获得基因突变株＊hyl。突变株在体外的生长能力低于野生株。结论：hyl基因突变株构建成功,hyl基因在生长中起着重要的作用,可能是屎肠球菌的毒力因子之一。     

野油菜黄单胞菌NK－01生物合成黄原胶的分子遗传学分析

本文采用甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）诱变野油菜黄单胞菌ＮＫ－０１得到多糖合成缺陷的不产粘突变株。经ＳａｌＩ部分酶切得到ＮＫ－０１染色体ＤＮＡ片段，将其连接到广泛寄主载体ｐＲＫ２９３上，在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中建立完整的ＮＫ－０１基因文库。在协助质粒ｐＲＫ２０１３存在下，不产多糖突变株分别与含基因文库的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落群进行三亲接合转移，筛选具有卡那霉素抗性的产粘接合后体。对接合后体进行重组质粒的酶切分析表明，所克隆的ＤＮＡ具有片段重叠。上述重组质粒对另外９株不产多糖突变株互补检测及遗传学分析表明，１３．４ｋｂ的ＤＮＡ片段含有合成黄原胶所必需的基因。     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌标准株mazEF6缺失株的构建

为构建结核分枝杆菌标准株H37Rv毒素-抗毒素系统maz EF6基因缺失突变株。采用聚合酶链反应(PCR)技术,分别从H37Rv和PUC-19K质粒上扩增出maz EF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;应用融合PCR技术将maz EF6基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,并将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF6-kan,将构建的自杀质粒转化至大肠杆菌DH5a中;利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv标准株中;并将该菌株涂于卡那霉素抗性改良罗氏培养基,培养3-4周后,刮取能在卡那霉素抗性培养基中生长的结核分枝杆菌单个菌落,以提取的阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段,并测序。对所获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株进行遗传稳定性检测。结果显示,该缺失株在15代内未发生回复性突变,成功获得H37RvΔmaz EF6缺失突变株。由此可知,本研究为今后研究毒素-抗毒素系统maz EF6基因的生物学功能奠定基础。     

羊种布鲁氏菌新疆流行株015株sodc基因缺失株的构建与初步评价

为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然后在双酶切后将上下游同源臂序列连接至自杀载体p GEM-7Zf+上,分别得到了p GEM-7zf-Δsodc,再将Sac B基因单酶切后连接至上述载体上,构建成同源重组自杀质粒pss。经8%蔗糖平板筛选鉴定Sac B基因的活性。将构建好的自杀质粒分别电转化至布鲁氏菌015感受态细胞中,通过氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感筛选后获得了015Δsodc基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。通过检测侵染小鼠巨噬细胞cfu、缺失株免疫小鼠后体内Ig G,IFN-γ的水平,及脾脏cfu,对其毒力进行了初步评价。结果表明,该缺失株20代内未发生回复性突变,成功构建了具有非抗性基因标记的缺失株,并且015Δsodc细胞cfu、脾脏cfu,及IFN-γ的水平都显著低与亲本株015,说明毒力与亲本株相比有一定程度的下降。本研究可为今后布鲁氏菌致病机理及新疫苗的研究提供实验材料。     

Red/ET重组AHBA生物合成基因簇打靶载体的构建与鉴定

为确定3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)生物合成基因簇在链霉菌中与次生代谢产物的关系,运用PCR技术,从33株AHBA合酶基因阳性菌株扩增与AHBA生物合成基因簇中编码AHBA合酶(A)、氧化还原酶(O)、磷酸化酶(P)基因,获得24株AOP基因阳性菌株.根据靶基因A基因下游和P基因上游同源序列设计50 bp引物,中间插入卡那霉素抗性基因的DNA片段,进行PCR,获得外源DNA片段.经过电转化,将外源DNA片段和pKC1139-AOP重组质粒共转入含重组酶质粒大肠杆菌HS996/ pSC101-BAD-gba-(Tet).在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与重组质粒pKC1139-AOP上的AHBA基因簇的同源区域重组,构建了AHBA基因簇打靶载体.研究显示了Red/ET重组工作效率高、操作简单、精确的优点,可大大缩短构建打靶载体的时间.     

布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价

为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株,且该缺失突变株在15代内未发生回复性突变,遗传性稳定。将羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株、羊种布鲁氏菌043和M5以106 CFU剂量腹腔接种小鼠,进行体内感染试验,并以布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100∶1的感染比例侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。结果表明:与羊种布鲁氏菌043相比,羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株的载菌量几乎没有下降(P0.05),对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于相似(P0.05);侵染小鼠巨噬细胞试验结果与动物感染试验结果也趋于一致(P0.05),这表明BR0524基因的缺失不会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生显著的影响。     

结核分枝杆菌Hsp16.3单克隆抗体的制备及其特性鉴定

制备抗结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。将含目的基因的表达载体pProEXHTb-Hsp16.3,通过E.coli DH5α诱导表达,获得含有6譎is的Hsp16.3蛋白,采用Ni-NTA纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化,并用透析方法进行蛋白复性。将复性的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的Hsp16.3阳性杂交瘤细胞株分别利用间接ELISA法和Western blot方法进行效价、相对亲和力及特异性的测定。获得了三株Hsp16.3的单克隆抗体,分别命名为3H6F9、1D5E1和4H8G6,其效价分别为1:1?07、1:1?06和1:1?06,相对亲和力分别为0.0001 mg/mL、0.001 mg/mL和0.001 mg/mL,并且无交叉反应性。所获得的结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体效价高、特异性强,为进一步研究Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用提供了有效的工具。     

关于小分子热休克蛋白Hsp16.3各功能区作用的初步研究

小分子热休克蛋白Hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了Hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌中分别克隆、表达和纯化了N端区或C端区缺失的两个Hsp16.3残体蛋白.远紫外和近紫外圆二色谱分析结果显示,残体蛋白表现出与野生型蛋白相似的二级和三级结构.在九聚体野生型蛋白进行亚基重组装时,C端缺失的Hsp16.3残体蛋白能与野生型蛋白发生相互作用,形成异源寡聚体.在对野生型蛋白进行胰酶消化时,Hsp16.3的α-crystallin域对胰酶的消化具有抵抗能力.所有这些结果显示:在Hsp16.3的3个功能区中,α-crystallin域是一个相对独立和稳定的结构单元,它对该蛋白各级结构的维持十分重要.     

A preliminary study on functional domains of small heat shock protein Hsp16.3

Hsp16.3, the small heat shock protein (sHSP) from Mycobacterium tuberculosis, was originally identified as an immunodominant antigen,which possesses three functional domains typical of sHSP family, namely the N-terminal hydrophobic region, α-crystallin domain and a short non-conserved C-terminal extension.To further understand the functional assignment of these independent regions, the three functional domains of Hsp16.3 were defined and the two N- or C-terminal truncated Hsp16.3 remnants were successfully cloned, expressed and purified.In the far and near circular dichroism analysis, the results showed that these remnants expressed similar secondary and tertiary structures to that of wild-type protein.During the reassembly of wild-type nonamer, the C-terminal truncated remnant could interact with the wild-type protein to form hetero-oligomers.When trypsin is used to digest the wild-type Hsp16.3, its α-crystallin domain could resist such degradation.Taken together, these results indicate that the stable secondary and tertiary structures of Hsp16.3 are mainly kept by its α-crystallin domain.     

叶轮进口边位置对自吸泵性能的影响分析

为研究自吸泵叶轮气液混合能力对自吸性能的影响,在叶轮原模型基础上,设计了叶片不同进口边位置的5种模型方案.采用VOF多相流模型对不同方案全流域进行三维定常数值计算,研究对自吸性能的影响规律.针对350WFB-1200-50型外混式无密封自吸泵,初始条件设定进水S型弯管中含一定体积的空气段,出口处设置含气率监测点.结果表明:针对中高比转速叶轮,进口边沿后盖板位置向出口前掠,使得叶轮进口边工作时对流体分时加载,可以有效提升叶轮的气液混合能力,从而缩短自吸泵的自吸时间;在一定前掠角度范围内改变进口边位置对自吸泵的扬程和效率影响不大,但是当叶片进口边向出口位置前掠超过一定范围时,会导致自吸泵扬程明显下降;当叶轮进口边前掠10°时,额定工况下自吸时间缩短25％,自吸性能明显得到提高.     

由对诗人的重估到对新诗史的重构--从《诗刊》看五四以来的新诗传统在五、六十年代的命运

作为二十世纪五六十年代国内最权威的诗歌刊物《,诗刊》无疑代表了当时的文学潮流,并引领着文学的走向。研究自1957年1月到1965年停刊的《诗刊》,可以清晰地把握当时的诗坛动态和文学环境,不失为五六十年代中国文学的一份生动史料。本文着重考察的是《诗刊》如何以对“五四”以来新诗人的重估和对新诗史的重构,完成了新诗在五六十年代的历史叙述。     

湿度传感器稳定性的误差来源分析

阐述了湿度传感器稳定性的误差,指出影响湿度传感器稳定性的误差有线性误差、温度影响误差、湿滞误差以及校验标准误差等.     

技术异化的生成

从技术的复杂性和局限性、技术的不恰当使用、自然的不可预见性、技术理性的沙文主义式扩展及社会文化等几个方面探讨了技术异化产生的根源。     

对图书馆读者满意度问题的思考

分析了图书馆读者满意度的含义及衡量要素,论述了图书馆调查读者满意度的目的及方式,提出了图书馆提升读者满意度的策略。     

业务外包对图书馆可持续发展的影响

介绍了目前图书馆业务外包的外延和内涵,论述了业务外包之后的图书馆办馆效益,分析了业务外包带来的问题,对业务外包后的图书馆事业可持续发展进行了思考。     

迎接知识经济的挑战 加强高校图书馆建设

在知识经济的背景下,图书馆的工作职能将发生显著变革,知识经济时代图书馆将面临新的机遇与挑战。图书馆要适应知识经济的需要,就必须加强自身建设,提高人才素质是决定性因素;网络建设是必由之路;现代化的科学管理是关键环节。