北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体P184Q的酶学性质表征

通过分析谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶(AK)的结构,筛选可能影响别构抑制剂结合的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功筛选出突变菌株P184Q.酶学性质研究表明:突变体P184Q的V_(max)比野生型(WT)提高了3倍;n=1.39,低于WT的值(2.6),正协同性下降,同时Km值减小,对底物的亲和力增大;P184Q最适pH=6.5,最适反应温度为25℃,半衰期为2.8h;P184Q对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性,解除抑制剂苏氨酸和甲硫氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸、赖氨酸对酶活力的抑制作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶M372I-T379S双突变体的构建及其酶学性质

为构建高酶活力天冬氨酸激酶(aspartokinase, AK), 并削弱或解除Lys(lysine)反馈抑制作用突变体, 通过定点突变和高通量筛选技术构建突变体M372I,T379S和M372I-T379S, 对野生型（WT）和突变体分别进行诱导表达、 纯化及酶学性质表征. 结果表明： 突变体M372I,T379S和M372I-T379S AK与WTAK相比, V_max分别提高了13.77,15.02,15.60倍, K_m和n值均降低； 最适pH值分别升高为8.0,8.5,8.5, 且半衰期分别延长了1.0,0.9,2.3 h； M372I-T379S AK最适温度为30 ℃, 比WT AK高2 ℃； 当浓度为1~10 mmol/L时, 突变体均削弱或部分解除了抑制剂Lys的反馈抑制作用.     

米曲霉(Aspergillus oryzae)植酸酶的分离纯化及性质研究

从5株霉菌中筛选出1株产胞外植酸酶最高的菌株(Aspcrgillusoryxae;简称霉菌3号)。经发酵,硫酸铵分级沉淀,Sephadex G—100凝胶过滤、SE—Sephadex G—50层析和电泳分离,获得2种植酸同工酶.此两种酶的分子量为40000d,等电点分别为4.5和4.8,最适pH为2.7和5.6,最适温度为50℃,K_m值为50μmol/L。SDS、Fe_~(2+)对酶活力无影响;Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)有激活作用;Cu~(2+)有抑制作用。     

球孢白僵菌017壳聚糖酶的研究I酶制剂的基本特征

球孢白僵菌017突变菌株(Beauveria bassiana 017)在CTN培养基(含0.2～1％壳聚糖,0.075％KH_2PO_4,0.05％MgSO_4,0.05％NaCl,0.001％FeSO_4,0.3％KNO_3,0,1％牛肉膏,pH5.0)中,20～30℃,200r·p·m振荡培养7天,可以分泌大量的胞外壳聚糖酶,对底物水解的最适温度为45～50℃,最适pH值为3.8～4.0。K_m值和V_(max)分别为2.17×10~(-6)M和0.45μmol/min,60℃保温1小时,剩余酶活性为10％,Ca~(2+),Mn~(2+)和Mg~(2+)对酶有激活作用,Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶有部分抑制作用,Hg~(2+)和Ag~+则强烈抑制酶的活性。     

产生淀粉糖化酶菌株的分离以及酶性质的初步研究

从霉变物、土壤、醋曲、醋醅等分离出四株产生淀粉糖化酶且酶活较高的菌株,选取酶活最高的菌株vin-1作为出发菌株,初步鉴定为Aspergillus niger,其生淀粉糖化酶活力达到342U/g(干曲),酶最适作用温度为55℃,酶在pH值3．5～4．5之间有较高的酶活,最适pH值为4．0,Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶有一定的激活作用,而Fe~(2+)、K~+、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)都有较强的抑制作用,Mn~(2+)抑制作用最大,达到近50%。     

两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析

为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84 U/mg和235.14 U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Zn ~(2+)可以提高MIME1的活性,其中Cu~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Ca~(2+)、Mn~(2+)对MIME1的活性则有抑制作用;Mn~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)和Ca~(2+)对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn~(2+)激活作用最为明显,而EDTA、Cu~(2+)和Zn~(2+)则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.     

果胶酶催化条件探索及澄清果汁的研究

测定了黑曲霉JB513果胶酶催化果汁澄清的最适条件.并对影响果汁澄清的其它因素进行了考察,结果表明,适量的明胶可使果汁澄清的时间缩短;纤维素酶有利于果汁的澄清;金属离子Ca~(2+),Mg~(2+)对果胶酶有激活作用,Sn~(2+),Fe~(3+)对果胶酶有抑制作用.     

酯酶基因Est2的异源表达及酶学性质研究

对来自α/β水解酶超家族的酯酶基因Est2进行了克隆、异源表达及纯化,然后对其酶学性质进行了研究.研究结果显示:酯酶Est2的最适底物为对硝基苯乙酸酯(p-NPC_2),最适反应温度为50℃,最适pH为8.0;Est2具有较好的pH稳定性,在pH 5.0～10.0范围内,其相对酶活性保持在50%以上;在40℃条件下具有最好的温度稳定性,在40℃耐受1 h之后仍有大于60%的酶活性;金属离子Fe~(2+)和有机试剂甲醇对酯酶Est2的酶活性具有激活作用.酯酶Est2在不同pH缓冲液中的稳定性以及对于Fe~(2+)和有机试剂较好的耐受性,暗示其具有较好的潜在工业应用价值.     

硫化氢对拟南芥在干旱胁迫条件下的生理影响

以拟南芥野生型(WT)和H2S体内生成的关键酶编码基因LCD敲除突变体为实验材料,研究了内源H2S在干旱胁迫下对种子萌发和幼苗生长过程中抗氧化能力的影响.结果表明:lcd突变体与WT相比,干旱胁迫下种子的萌发受到显著抑制,萌发率下降约40％;幼苗体内的MDA含量显著增加,达到WT的1.56倍,差异极显著;同时幼苗体内的H2O2明显增加.正常条件下,lcd与WT相比各抗氧化酶活性均没有显著差异;干旱胁迫后,lcd的POD、CAT、SOD和APX的活性分别升高2.11、1.48、2.22和1.37倍,差异极显著;且与胁迫后的WT相比,这些指标也表现出显著性增高.以上结果表明内源H2S作为信号分子通过对抗氧化系统的调节,影响拟南芥种子萌发和幼苗生长发育.     

甜菊叶片细胞UDPG PPLase基本特征及电镜细胞化学定位

经硫酸铵分级、DEAE-纤维素和葡聚糖凝胶柱层析,叶中UDPG PPLase被纯化166倍,该酶最适反应温度32℃,最佳反应pH8.0.2mmol/L的Ca~(2+)和5mmol/L的Mg~(2+)对该酶有较好激活效果,但无绝对依赖关系,Pb~(2+)对该酶有较强抑制作用,亚细胞分级分离结果表明95％的UDPG PPLase活性分布于46000×980cm /s~2上清液;电镜细胞化学定位研究表明,该酶主要定位于液泡、高尔基扁平囊和高尔基小泡;还讨论该酶在甜菊糖甙生物合成中的作用。     

异常毕赤酵母产生耐温酸性脂肪酶的研究

采用 Rhodamine B指示剂染料法和三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法 ,从 2 3 7份土壤样品中分离得到一株酵母菌 1 0 1 3号 ,能较稳定地产生耐温酸性的脂肪酶 .该菌株经中国科学院微生物研究所鉴定为异常毕赤酵母 ( Pichia anomala) .其产酶培养基组成 ( % ) :豆饼粉 2 .0 ,麦麸 1 .0 ,NH4 NO3 0 .4 ,KH2 PO4 0 .3 ,Mg SO4 · 7H2 O 0 .2 5,豆油 1 .0 .产酶最佳条件 :发酵起始 p H 5.8,温度 2 8℃ ,周期 3 6h.酶最适作用温度4 8℃ ,最适 p H 4 .8.在 p H 4 .8,50℃条件下 4 0 min能保持 60 %以上酶活 .Mg2 + 和 Na+ 对酶有激活作用 ,Zn2 + 、Fe2 + 、 Cu2 + 和 EDTA有抑制作用 .     

三氟氯氰菊酯对棉铃虫中枢神经细胞高电压激活Ca~(2+)通道激活的影响

用全细胞膜片钳技术分析了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)幼虫中枢神经细胞电压门控Ca~(2+)通道的电生理学特性,并检测了三氟氯氰菊酯(cyhalothrin,Cyh)对Ca~(2+)通道功能特性的影响.结果表明,Ca~(2+)通道电流(I_(Ca))激活阈值-40 mV,峰值电压介于-10 mV-10 mV.约82%细胞的I_(Ca)在-20 mV激活,93%细胞的I_(Ca)在0 mV左右达峰值.棉铃虫表达高电压激活、对Cd~(2+)敏感的Ca~(2+)通道和高电压激活、对Cd~(2+)不敏感的Ca~(2+)通道.Cyh作用后,I_(Ca)在幅值减小的同时,I-V曲线和激活曲线均向超极化方向移动10-20 mV,表明Cyh不仅对I_(Ca)有抑制作用,对Ca~(2+)通道的激活也有影响,棉铃虫幼虫腹神经索中枢神经细胞高电压门控Ca~(2+)通道也是Cyh的作用靶标之一.     

β-环糊精衍生物对脲酶抑制作用的研究

利用Mg~(2+)和双-[6-氧-(3-脱氧柠檬酸酯)]-β-环糊精·Mg~(2+)(简称配合物)对脲酶抑制作用进行了研究得到Mg~(2+)对脲酶有激活作用,而配合物对脲酶是抑制作用。     

中华管鞭虾多酚氧化酶生化特性研究

对中华管鞭虾中多酚氧化酶(PPO)的活性及其影响因素进行研究,讨论了最适反应温度、pH、特异性底物及其酶动力学性质,激活剂对酚氧化酶的激活作用,抑制剂对酚氧化酶的抑制作用。结果表明:中华管鞭虾酚氧化酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0;十二烷基硫酸钠(SDS)对PPO的激活作用最大,其次为胰凝乳酶和β-葡聚糖,激活率分别为71.9%、62.4%和33.4%;4-己基间苯二酚对PPO抑制作用最强。     

硫化氢参与镉诱导拟南芥气孔的关闭

以拟南芥为实验材料,利用分光光度法、显微观测法及药理学实验,研究了镉(Cd~(2+))、硫化氢(H2S)和脱落酸(ABA)处理对拟南芥野生型(wild type,WT)、abi5和lcd气孔运动的影响,以及H_2S合成酶L-半胱氨酸脱巯基酶(LCD)的活性和体内H2S含量的变化。结果表明:光照条件下,随着Cd~(2+)浓度的增加,野生型拟南芥气孔孔径逐渐减小,LCD的活性及内源H_2S含量依次升高。200μmol/L的CdCl_2可以减小abi5的气孔开度,且50μmol/L的H_2S也可以减小abi5和WT的气孔开度,而ABA并不能减小abi5的气孔开度,说明Cd~(2+)诱导的气孔关闭主要依赖H2S信号。实验进一步验证了这种现象:与WT相比,200μmol/L的CdCl_2对LCD缺失突变体(lcd)气孔开度的影响不大,加入H2S的供体NaHS后,lcd气孔关闭。研究发现,Cd~(2+)可通过增强LCD的活性,促进L-半胱氨酸分解生成H_2S,进而诱导拟南芥气孔关闭     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究

[目的]分离纯化来源于内生枯草芽孢杆菌YZ-21的β-甘露聚糖酶,并研究其酶学性质.[方法]采用乙醇沉淀法、硫酸铵盐析法、聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH_4)_2SO_4]双水相体系进行分离与纯化,在此基础研究它的酶学性质.[结果]比较3种纯化方法,最优方法为双水相萃取法,在双水相体系为16%(NH_4)_2SO_4、18%PEG2000、2%NaCl条件下,纯化倍数最高可以达到3.06,酶回收率达到99.26%;酶学性质研究表明,β-甘露聚糖酶的最适反应pH为7.0,最适的反应温度是40℃,pH稳定性在3.0～7.0,热稳定范围在35～55℃之间;Ca~(2+),Ba~(2+),Mg~(2+),K~+,Co~(2+)对酶都有激活作用,而Ca~(2+)激活作用最强,Cu~(2+),Na~+,Zn~(2+),Mn~(2+),EDTA对酶有抑制作用.[结论]利用双水相萃取法较好纯化了β-甘露聚糖酶,酶学性质良好,可以广泛应用于饲料添加剂、纸浆漂白和食品加工等领域.     

低温胁迫下交替氧化酶在拟南芥植株幼根生长中的作用

以交替氧化酶(Alternative Oxidase;AOX)基因反义抑制突变体(AS-12)、超表达突变体(XX-2)及野生型(WT)拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株为实验材料,研究了低温胁迫(4℃)对3种基因型拟南芥植株主根的长度、生长速率以及细胞活力的影响.结果显示:在22℃生长条件下,3种植株主根的长度、生长速率及细胞活力均无显著性差异.与在22℃下相比,低温胁迫明显降低了3种植株主根的长度、生长速率和细胞活力;在低温胁迫下,XX-2植株的主根明显长于AS-12和WT,其主根的生长速率和细胞活力也明显高于AS-12和WT.上述结果表明,低温胁迫下拟南芥主根的生长及其细胞活力可能受到了AOX基因的调节.讨论了AOX在低温胁迫条件下对植物幼根生长作用的可能的内在机理.     

极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

选择来源于极端嗜热菌Thermosipho melanesiensis(DSM12029)的普鲁兰酶基因,以购自德国菌种保藏中心的基因组为模板,扩增出普鲁兰酶基因TM-pulA;利用酶切酶连构建了重组质粒pET21a-TM-pulA;转入大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达并经纯化后,进行了水解产物分析和酶学性质测定.结果显示:TM-pulA为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH为5.8;最适温度是80℃;70℃下半衰期为4.75 h;Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对其酶活有不同程度的抑制作用;该酶的K_m、V_(max)、K_(cat)及K_(cat)/Km值分别为4.68 g·L~(-1)、0.0085 mmol·L~(-1)·s~(-1)、71.18 s~(-1)、15.21 L·g~(-1)·s~(-1).     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。