甜酸角基因组微卫星序列特征分析

甜酸角是干热河谷地区有多重价值的重要经济树种,对其SSR引物的开发有助于该物种的遗传学研究以及资源的利用与保护.研究通过Illumina高通量测序技术和MISA软件开发出甜酸角全基因组SSR序列,共7个类型9 447个,其中以单核苷酸重复类型最多.在不同重复类型中,A/T碱基含量显著高于G/C;在不同长度重复单元中,单核苷酸重复类型的微卫星长度变异程度最高,二核苷酸重复类型微卫星长度变异程度也较高,各重复类型微卫星的长度与微卫星出现的频率呈负相关.获得的微卫星序列以及相关分析结果,较全面地反映了甜酸角基因组微卫星的特征和潜在功能,将有助于后续的一系列遗传学研究.     

长薄鳅基因组四碱基重复微卫星的分离及序列特征分析

采用生物素探针(GATA)8杂交和磁珠富集法直接从长薄鳅基因组中分离出了一批四碱基重复微卫星DNA,并对其序列特征进行了分析.随机挑取200个单克隆进行筛选,得到175个阳性单克隆(87.5%).测序发现共有117个阳性克隆含有微卫星重复单元.通过序列比对,排除重复测的序列后,得到91条重复类型和重复次数不同微卫星的序列,其中含四碱基重复的微卫星有62条.与探针相同或互补(GATA/CTAT)n的四碱基重复微卫星位点数最多,此外,还检测到其它的四碱基重复类型,如(AGAC/TCTG)n、(AAGA/TTCT)n、(GATG/CTAC)n,以及(CT)n＋(ATAG)n和(AT)n＋(ATAG)n二碱基和四碱基复合型微卫星位点.获得的长薄鳅基因组四碱基重复微卫星位点中,属于完美型的最多,有30条(48.4%),其次为复合型,有29条(46.8%),非完美型的有3条(4.8%).大多数的四碱基微卫星(31条)重复次数为10～19次,占50.0%,其次为20～29次和5～9次四碱基重复,均为22.6%,30次以上的四碱基重复较少,仅有3条(4.8%).     

白鹭基因组微卫星分布规律研究

【目的】研究白鹭(Egretta garzetta)的全基因组微卫星分布规律。【方法】利用生物信息学方法对已报道的白鹭全基因组进行查询和分析。【结果】白鹭全基因组中1～6个碱基重复的微卫星有255 630个,序列总长度为4 282 844bp,占全基因序列长度的0.37%。不同重复类型的微卫星中,单碱基的数量最多,有207 108个,占全部类型的81.0%;然后依次是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基,分别占全部类型的6.4%,5.3%,4.9%,2.0%和0.4%。A,C,AC,AT和AG是白鹭基因组微卫星序列中重复数量较多的拷贝类型,占全部重复类型的87.4%。在白鹭基因组中,按降序排列,重复类型出现次数超过1 000次的有17个,分别是T,A,AT,G,C,AC,GT,ATT,AAT,ATTT,AGG,AAAC,CCT,AAAT,CT,GTTT和AG,占全部微卫星数量的92.7%。【结论】研究结果对白鹭微卫星的筛选及深入研究提供了数据支持。     

日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）基因组微卫星特征分析

通过建立随机基因组文库和序列测序,对日本囊对虾基因组进行了较大规模的微卫星分布特征分析.在1606711bp的随机基因组序列中,共找到1206个微卫星序列,其序列总长度约占测序序列总长度的5.9%.微卫星序列中,以两核苷酸重复的序列数目最多,约占微卫星总数的69.82%,三核苷酸重复次之,约占12.35%.两核苷酸重复中以AT重复最为丰富,约占两核苷酸重复序列总数的29.44%.微卫星在低拷贝区间(≤42)数量相对较大,约占比例为72.31%.重复单位拷贝数的变异能力分析表明,变异系数最大的前3种重复类型,均为4—6核苷酸,较长重复单位类型有着较强的变异能力.微卫星重复单位长度与其拷贝数的相关分析表明,二者呈负相关(r=-0.428),即随着重复单位长度的增加,其拷贝数在减少.两核苷酸重复4种类型和三核苷酸重复10种类型基序AT含量与重复序列数目的相关分析表明,随着重复类型基序AT含量的增加,其相应的序列数目增多.同时,微卫星各重复类型基序GC含量在0—70%间时,两端侧翼序列GC含量与之存在着正相关关系.这可能意味着微卫星两端的侧翼序列的碱基组成对微卫星的产生和进化有一定的影响.以上结果为物种间微卫星分布频率和丰度的比较、微卫星标记开发以及微卫星进化和功能的研究等工作提供基础.     

水稻亚种间基因组水平微卫星多态性分析

从公布的水稻两个亚种（籼稻9311和粳稻Nipponbare）基因组草图序列中,搜寻了所有的完整微卫星位点,发现单碱基重复中A/T重复占大多数,二碱基重复中AT/TA、GA/TC、AG/CT重复居多,三碱基中GGC/GCC、GCG/CGC、CCG/CGG重复较多。通过相互比较,不同基序和基因区域的微卫星多态性有较大差异：内含子和基因间区中微卫星的多态性较高（分别约为45%和40%）,外显子中的微卫星多为三碱基重复,而且多态性较低（约为25%）;两个亚种具多态性的微卫星间距平均约为12.7 kb和16.4 kb。     

基于NCBI核酸数据库资源的产黄青霉微卫星序列的筛选

利用生物信息学方法在产黄青霉基因组中筛选微卫星序列,并对其基因组中微卫星数量和丰度进行了研究.利用SSRHunter1.3软件在长度为30 090 464 bp的产黄青霉基因组中共找到163个微卫星序列.其中以两碱基重复类型数目最多,为133个,占重复序列总数目的 81.60%;其次是三碱基重复为29个,占17.79%;最后是四碱基1个,占0.61%.在两碱基重复序列中,AT(44.79%)重复类别最多,其次是AG(23.92%).在三碱基重复序列中,共发现9种重复类别,其中以AAG和ACT重复类型最多,为6个(3.68%),其次是ACC(2.45%),最少的是AGC(0.61%).四碱基重复中,只有1种重复类别,为ATGT(0.61%).同时选取二碱基的重复次数在7以上和三碱基的重复次数在6以上的微卫星序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了引物,共得到30对引物.本研究不仅为后续产黄青霉微卫星标记的筛选奠定了基础,也丰富了其基因组学资源,对产黄青霉的种群遗传结构分析、分子标记选育和遗传多样性有重要意义.     

碧桃花瓣转录组微卫星特征分析

为开发碧桃转录组微卫星信息,利用454高通量测序技术,对其花瓣转录组序列进行SSR位点发掘,结果发现含SSR的序列4 705条,共得到5 668个SSR,平均每3.49 kb出现1个SSR。微卫星序列主要以三碱基重复为主,约占总数的42.66%。笔者共发现516种碱基重复基元,所占比例最高的为(AG/CT)n(18.34%),其次是(AAG/CTT)n(12.42%)。微卫星多为重复长度小于20 bp的短序列,长度大于20 bp的微卫星仅占总数的12.13%。研究还发现碧桃花瓣微卫星的频率和长度呈显著负相关(P0.05),相关系数为-0.246。     

绿头鸭基因组微卫星分布规律研究

[目的]研究绿头鸭(Anas platyrhynchos)的全基因组微卫星分布特征及规律.[方法]利用生物信息学方法对已报道的绿头鸭全基因组查询搜索并进行特征分析.[结果]在绿头鸭1 070 Mbp的基因组中,1～6个碱基重复的微卫星数量有476 957个,总长度为9 101 935 bp,相对丰度为445.77个·Mb-1,占全基因长度的0.83％.不同重复类型的微卫星中单碱基的数量最多,有326 468个,长度为5 444 144 bp,占基因组微卫星总数的68.45％;然后依次是四碱基、二碱基、三碱基、五碱基和六碱基,数量分别为66 753,30 262,29 712,20 248和3 514个,长度分别为1 504 868,501 244,527 310,920 915和203 454 bp,分别占基因组微卫星总数的14％,6.34％,6.22％,4.25％和0.74％.绿头鸭基因组中,分布数量最多的14种拷贝类型按数量由多到少排列依次是A,A A AC,A A AT,AT,A AT,AC,A AC,A A A AC,C,AG,AAAAT,AAAG,AAGG和AGG,这些拷贝类型的数量均超过2 500个,合计占基因组微卫星总数的95.1％,有明显的A偏倚.[结论]研究结果为绿头鸭微卫星的筛选和开展进一步的分子生物学研究奠定了基础.     

3种金线鲃属鱼类基因组微卫星的筛选与分析

利用生物信息学的方法,基于已公布的滇池金线鲃、安水金线鲃和犀角金线鲃的全基因组序列,筛选出3种金线鲃全基因组中的微卫星,并对所得数据进行分析。结果显示:在滇池金线鲃、安水金线鲃和犀角金线鲃全基因组中分别筛选出完美微卫星851 732个、849 226个和848 258个,其丰度分别为543. 39个/Mb、561. 32个/Mb和557. 52个/Mb; 3种金线鲃鱼类基因组中二碱基重复类型最多,分别占全部微卫星总数的50. 24%、40. 72%和40. 72%,其次是单碱基四碱基三碱基五碱基六碱基;安水金线鲃和犀角金线鲃基因组中的核心重复类别比例最高的为A,而滇池金线鲃核心重复序列比例最高的为AC; 3种鱼类基因组微卫星序列分布结果表明,位于外显子上的数量远低于内含子和基因间隔区。     

基于转录组的曼氏无针乌贼SSR与SNP位点信息分析

利用IlluminaHiseq平台对曼氏无针乌贼进行了转录组测序,采用生物信息学方法分析了转录组序列中的SSR、SNP位点信息并设计了SSR引物。利用MISA工具筛选了转录组测序获得的127 575条Unigene序列,共得到分布于50 626条序列中的SSR位点108 685个,SSR发生率39.68%,出现频率为85.19%。平均每949 bp含有1个SSR位点。在50626条含有SSR位点的Unigene序列中,有25 548条Unigene包含SSR位点数目在2个及以上。其中单碱基重复是EST微卫星序列的主要形式(42.84%),其次是二碱基重复(28.73%),三碱基重复(14.93%)和四碱基重复(12.79%)。在所有微卫星序列所包含的重复单元中,优势重复基元类型为A/T(占总SSRs的42.23%),其次为AT/AT (13.33%),AC/GT (9.32%),AAAG/CTTT(10.00%)。运用Primer premier 5软件共设计了46 520对SSR引物。在12 323条Unigene中发掘出SNP位点64 732个,每条Unigene平均含5.25个SNP位点。其中转换(Transition) 45 975个(71.02%),颠换(Transversion) 18 757个(28.98%)。本研究通过第二代高通量测序技术,结合生物信息学方法对曼氏无针乌贼进行了SSR位点与SNP位点的开发,为其遗传多样性分析、分子辅助育种和增殖放流效果评估等提供了有力研究工具。     

Characterization, development and exploitation of EST-derived microsatellites in Gossypium raimondii Ulbrich

COTTON IS AN IMPORTANT GLOBAL CASH CROP. IN THE RECENTYEARS, MOLECULAR MARKER TECHNOLOGY HAS BEEN WIDELY APPLIED TO SUCH STUDIES ON COTTON AS GENETIC MAP- PING[1―4], VARIETY PURITY DETECTION[5], GENETIC DIVERSITY ANALYSIS[6], MOLECULAR MARKER-ASSISTED BR…     

湿地松转录组SSR分析及EST-SSR标记开发

【目的】湿地松是南方地区优先推广的优质产脂树种。但湿地松分子遗传基础薄弱,基因组序列信息匮乏,影响了湿地松基因组学的深入研究。目前,湿地松分子研究所用的SSR标记主要来自其他近缘种或利用公共数据库中有限的基因序列资源开发的SSR标记,其多态性和通用性较差。为解决这一问题, 笔者根据湿地松转录组测序数据开发EST-SSR位点,并揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为湿地松分子标记辅助育种奠定基础。【方法】利用MISA软件对转录组序列进行SSRs查找和分布特征分析。查找标准参数设置为: 单核苷酸重复>10次,二核苷酸重复>6次,三、四、五、六核苷酸重复>5次。根据SSR位点两端的保守区域,利用Primer3.0设计并随机挑选120对SSR引物,通过琼脂糖电泳和毛细管电泳对来自美国和吉安的113份家系个体进行遗传多样性分析,确定引物多态性。【结果】79 574条unigenes序列中搜索到3 818个SSR位点,出现频率为4.80%,平均18.27 kb出现1个SSR位点,3 373个unigenes含有SSR位点,SSR发生频率(含SSR位点的序列数/搜索序列总数)为4.24%,其中2 980条序列含1个SSR位点,含1个以上SSR位点的序列有393条。在检测到的3 818个SSR标记中,单核苷酸分布最多,其次是二核苷酸和三核苷酸,SSR数量分别占总数的63.54%、19.15%和16.27%,而四、五、六核苷酸重复类型所占比例较小,分别为0.52%、0.13%和0.31%。SSR重复单元的重复次数分布在5~22次之间,除单核苷酸重复外的1 391个SSR中,重复5次的数量最多,为498个(35.80%);重复6次和7次的次之,分别为417个(29.98%)和198个(14.23%);重复10次以上的仅有38个(2.73%)。在检测到的731个二核苷酸重复SSR中,最常出现的重复单元为AT/AT,数量为491个(12.86%),AG/CT和AC/GT两种类型的重复单元出现的次数次之,分别为156(4.09%)和81个(2.12%)。在检测到的621个三核苷酸重复中,AAT/ATT是出现频率最高的单元,共139个(3.64%),其次是AAG/CTT,共122个(3.20%)。3 818个SSR中有24.59%的位置未知,其余的SSR则分布在非编码区域(untranslated region,UTR)或者编码区(coding sequence,CDS)上,分布数量表现为3'UTR>5'UTR>CDS。参试的120对SSR引物,有92对扩增成功(76.78%),其中24对呈现多态(20%)。24对引物(13个二核苷酸重复、7个三核苷酸重复和4个四核苷酸重复)共检测出81个等位基因,每个位点的等位基因数为2~9,平均为3.38个。多态性信息含量(polymorphism information content,PIC)为0.103~0.726,平均为0.349。【结论】通过对湿地松转录组数据的挖掘,共获得 3 818个SSR位点,主要重复单元为AT/AT和AAT/ATT,可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于湿地松转录组序列的SSR标记开发是可行的。     

松属编码区微卫星特征和相应基因功能分析

从GenBank下载453 892条松属EST序列,序列组装后得到20 886条contig。用Sputnik软件从这些contig中查找了2 678个微卫星,其中3碱基重复微卫星占的比例最高,为59.2%,而其他重复长度的微卫星都相对较低,比例分别为:2碱基重复微卫星占12.0%,4碱基重复微卫星占13.3%,5碱基重复微卫星占15.5%。3碱基重复微卫星变化引起的基因读码框改变最小,松属树种基因区3碱基重复微卫星的富集显示了强烈的密码子选择效应。此次研究还对查找到的微卫星进行了引物设计和扩增分析。实验结果显示,设计的微卫星引物在云南松中的扩增成功率是72.9%。从扩增成功的引物中进一步选取了155对引物,对14个松属树种和1个黄杉属树种进行了引物通用性实验分析,结果显示155对引物在14个松属树种间的通用性在71.0%以上,而在黄杉属树种中的通用性只有25.2%。对松属树种中含有微卫星的基因进行了功能分类研究,结果显示基因在是否保留微卫星序列方面有显著分化,微卫星参与了如细胞成分分类的共质体组成、病毒颗粒及病毒颗粒组成、生物节律调控, 以及生长素转运蛋白等生物学过程。     

Analysis of tandem repeats in the genome of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis

Through random sequencing, we found a total of 884000 base-pairs （bp） of random genomic sequences in the genome of Chinese shrimp （Fenneropenaeus chinensis）.Using bio-soft Tandem Repeat Finder （TRF） software, 2159 tandem repeats were found, in which there were 1714 microsatellites and 445 minisatellites, accounting for 79.4% and 20.6% of repeat sequences, respectively. The cumulative length of repeat sequences was found to be 116685 bp, accounting for 13.2% of the total DNA sequence; the cumulative length of microsatellites occupied 9.78% of the total DNA sequence, and that of minisatellites occupied 3.42%. In decreasing order, the 20 most abundant repeat sequence classes were as follows： AT （557）, AC （471）, AG （274）, AAT（92）, A （56）, AAG （28）, ATC （27）, ATAG （27）, AGG （18）, ACT（15）, C （11）, AAC （11）, ACAT （11）, CAGA （10）, AGAA （9）,AGGG （7）, CAAA （7）, CGCA （6）, ATAA （6）, AGAGAA （6）.Dinucleotide repeats, not only in the aspect of the number,but also in cumulative length, were the preponderant repeat type. There were few classes and low copy numbers of repeat units of the pentanucleotide repeat type, which included only three classes： AGAGA, GAGGC and AAAGA. The classes and copy numbers of heptanucleotide, eleven-nucleotide and thirteen-nucleotide primer-number-composed repeats were distinctly less than that of repeat types beside them.     

Mining,characterization, and exploitation of EST-derived microsatellites in <Emphasis Type="Italic">Gossypium barbadense</Emphasis>

Simple sequence repeats (SSRs) have been widely applied as molecular markers in genetic studies. However, the number of ex-pressed sequence tags (ESTs) and SSR markers from Gossypium barbadense is fewer than those from other cotton species. In this study, EST-SSR distribution from G. barbadense was characterized and new G. barbadense-derived EST-SSR markers were de-termined on the basis of the ESTs obtained by randomly sequencing 2 cDNA libraries associated with fiber development in G. barbadense. By mining 9697 non-redundant ESTs, a total of 638 SSR loci derived from 595 ESTs were observed. In G. barba-dense, the frequency of ESTs containing SSRs was 6.13%, with an average of 1 SSR in every 10.4 kb of EST sequence. Further-more, trinucleotide was found to be the most abundant repeat type among 2–6-nucleotide repeat types. It accounted for 26.6% of the total, followed by the hexanucleotide (26.0%) and pentanucleotide repeats (25.9%). Among all the repeat motifs, (AAG)n accounted for the highest proportion. EST-SSR primer pairs were developed using the Primer3 program, and the redundant primers were removed using the virtual PCR approach. As a result, 380 non-redundant EST-SSR primer pairs were developed and used to detect polymorphisms between the mapping parents G. hirsutum ‘TM-1’ and G. barbadense ‘Hai7124’ for constructing linkage groups in cultivated allotetraploid cotton. Out of these, 98 (25.8%) primer pairs detected polymorphisms. Finally, 95 polymorphic loci from 82 primer pairs were integrated into the backbone genetic map; of these, 42 were mapped into the A subgenome and 53 into the D subgenome. The present work provided the foundation for constructing saturated genetic maps and conducting comparative genomic studies on different cotton species.     

Screening microsatellite markers from EST sequences of bay scallop Argopecten irradians

Seventy-five simple sequence repeats （SSRs） were identified by the bioinformatic analysis from 5008 expressed sequence tags （ESTs） of Argopecten irradians. Among the SSRs, the number of repeat nucleotide varied from 2 to 6. Dinucleotide and trinueleotide repeat motifs were dominant in EST-SSRs of bay scallop, with a proportion of 80% over the total screened SSRs. Twenty-nine pairs of primer were designed based on the flank sequences of the selected ESTs using the software of Primet 5, and verified under the given PCR reaction condition. Eighteen of the 29 primer pairs resulted in the expected products, while the remaining either failed to produce any fragments or yielded products over expected size. Thirteen of the 18 SSRs, accounting for 72%, were detected to show polymorphism in the examined scallop samples. A preliminary test in this study indicated that the majority of the identified SSRs were informative in the cultured bay scallops, making them suitable for the population and other genetic analysis. EST-SSR markers have more advantages than the traditional genomic-derived SSRs and there is a wide range of application in comparative mapping, functional gene cloning and marker assisted selection. This research provides a reference to the identification of EST-SSRs with relative bioinformatic analysis from aquaculture species, as well as to those with a large number of ESTs.     

杉木EST-SSR与基因组SSR引物开发

利用已经公布的杉木444条EST序列和未公布的杉木基因组文库中1 142条基因序列,进行引物开发效率的比较。去冗余后,利用MISA 搜索SSR 位点,分别得到109个和39个含有SSR的 位点。杉木EST序列中SSR分布密度为964.58个/Mbp,基因组中平均每Mbp出现1 037.24个SSR。在两个独立来源的数据库序列中,六核苷酸重复均为最多的重复类型,且AT-rich的重复类型占较大比例。AGC/CTG是杉木EST序列和基因组库中最多的三碱基重复,通过Primer 3.0分别设计出SSR引物95对和37对。为考察设计引物在杉木不同种源(群体)中的有效性,取12个种源(个体)的优良个体, 利用随机抽取的10个EST-SSR和8个gSSR(基因组SSR)进行引物筛选,结果表明:EST-SSR和gSSR各有4对引物在12个种源(个体)中表现出明显的多态性,多态率分别为40%和50%。8对多态性的SSR引物共扩增出 25 个多态性等位位点,平均每个引物产生 3.125 个多态性等位位点,平均有效的等位位点为2.399 5,PIC平均值为0.519 1; Hot平均为0.307 4。其中gSSR标记在检测群体间存在较大的分化,4个gSSR比4个EST-SSR扩增出更多的等位位点数、平均等位位点数,以及更大的PIC值。     

基于松材线虫全基因组序列的SSR标记开发

为了研究松材线虫在我国的群体遗传关系及传播路径,获得更为稳定的松材线虫分子标记,使用MISA软件对松材线虫全基因组10 432条DNA片段进行搜索,共获得95个gSSR位点。其中,二核苷酸重复出现频率最高,占全部SSR位点的66.3%。依据所有gSSR位点共设计出36对引物,以1份松材线虫DNA pooling(包含我国46个不同地理来源的松材线虫虫株DNA)为模板进行PCR,产物由QIAxcel全自动凝胶电泳分析系统检测,获得17对可能具有多态性的gSSR引物。进一步对这17对引物的PCR产物进行单克隆试验并测序,BioEdit软件拼接比对结果表明,其中9对确实具有多态性。     

刺参CT/AG微卫星标记的筛选

利用5’锚定引物PCT筛选刺参的CT/AG微卫星分子标记,测序的43个克隆子中,42条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到97.7%。去除重复序列后,共检测到56个微卫星位点,分布于26条序列中,其中25条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为(CT/AG)的有51个(91.1%),5个位点为其他类型的重复。结果表明:刺参CT/AG微卫星标记在刺参基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记,具有较强的筛选效率。