甲状腺癌组织中H-ras基因突变及蛋白表达的预后价值

对54例甲状腺癌标本分别用PCR-RFLP法检测H-ras基因第12位密码子的突变及免疫组化法检测p21ras蛋白,并用时序捡测分析ras基因突变和p21ras蛋白表达与甲状腺癌的关系.结果发现,甲状腺癌中18例(33.3%)有ras基因突变和49例(90.7%)有p21ras蛋白过度表达.临床分期晚、分化程度低的甲状腺癌突变率较高,具有H-ras原癌基因突变和p21ras蛋白阳性的病例有较高的复发率和死亡率.表明ras基因突变及其蛋白过度表达在甲状腺癌的发生和发展过程中发挥作用,是预后不良的标志.     

西安地区耐利福平结核杆菌rpoB基因突变特点

目的 阐明结核分枝杆茵耐利福平菌株rpoB基因的突变特征.方法 对包含81bp的利福平抗药性决定区(rifampicin-resistance determining region,RRDR)的30株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的PCR产物进行测序分析.结果 18株耐利福平菌株中,除一株发生了513,514位密码子的缺失突变外,其他菌株均发生了单核甘酸替换(单点突变),并且这些突变均发生在rpoB基因的RRDR区内.其中531,526,516位密码子的突变率分别为44.4%,27.8%,16.7%,它们之和为88.9%;12株利福平敏感株中有3株检出了与耐药性有关的基因突变.结论 西安地区结核分枝杆菌耐利福平菌株rpoB基因突变以点突变为主,缺失突变则比较少见.最为常见的突变分别位于531位、526位和516位密码子,其中531位密码子的突变率同其他位相比占有明显优势,且531住TCG→TTG突变在rpoB基因所有突变类型中具有最高的突变频率.     

Si-1基因中一个多态位点的初步分析

 通过PCR-RFLP技术分析了Si-1基因的外显子在肿瘤样本与正常人群外周血液样本的突变情况,初步确定了Si-1基因的第15号外显子的第56位发生点突变,突变类型为C—T的置换突变,其编码的P(脯氨酸)变化为S(丝氨酸).在正常人群外周血液样本中的突变频率为14%,而在肿瘤中的突变频率为24.7%,尤其在肠癌中的突变频率高达51.5%.上述结果表明Si-1基因的外显子的突变与肿瘤间有一定关系.     

动物源大肠杆菌染色体ampC基因突变与头孢菌素耐药关系研究

为检测动物源性大肠杆菌染色体ampC基因突变与头孢菌素类药物耐药性的关系,选取22株头孢菌素类药物耐药菌作为受试菌株,采用K-B纸片法测定了其对7种头孢菌素的敏感性,采用PCR测序的方法进行受试菌染色体ampC基因调控区和部分编码区碱基突变分析.结果表明:受试菌对7种头孢菌素的耐药率均在50%以上,20株受试菌ampC基因调控区和部分编码区碱基发生了突变,占90.9%;共有10种突变组合,突变频率最高的为+185,+58,+122,+126,-88,-82,-18,-1位.ampC基因调控区和部分编码区碱基突变与β-内酰胺类药物耐药性有关.     

液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测和分型中的应用

从50例疑似感染人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）患者的标本中提取DNA,运用液相芯片技术对提取的DNA进行7种低危型和19种高危型检测,并与反向点杂交检测结果进行比较.50例标本中,液相芯片检出阳性26例,阳性率为52%,其中单一亚型感染20例占40%,多重感染6例占12%,比反向点杂交的多重感染阳性检出率高4%.     

结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性的检测及耐药基因突变位点分析

为检测结核分枝杆菌链霉素(streptomycin,SM)耐药性,分析耐药基因突变,探讨DNA测序分析技术在结核分枝杆菌链霉素耐药性检测中的应用价值。采用方法:1、用传统的比例法药敏试验对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测。2、用DNA测序分析技术对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药相关基因Rpsl和rrs的突变位点分析,筛查耐药相关突变位点。3、探讨DNA测序分析技术对结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测的效率。结果:1、传统比例法药敏试验结果显示,49株实验菌株中16株为链霉素耐药株,33株为链霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA测序。结果显示:Rpsl基因只存在一个突变位点,为第43位密码子AAG的突变,突变形式为AAG→AGG,氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。rrs基因DNA测序结果发现:rrs基因共存在5个突变位点,分别为第513位碱基A突变为G、第523位碱基A缺失、第598位碱基A突变为G、第599位碱基A缺失、第612位碱基A缺失,其中第513位碱基突变只存在于链霉素耐药株中,其余4个突变位点在耐药株和敏感株中均存在。即初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。3、分析Rpsl基因和rrs基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性之间的关系,结果显示:16株链霉素耐药株中13株存在Rpsl基因第43位密码子的突变,1株存在rrs基因第513位碱基的突变。以传统的比例法药敏结果为参照,以DNA测序分析Rpsl基因或rrs基因发现Ppsl基因发生第43位密码子或rrs基因第513位碱基突变为判断菌株耐药的标准,DNA测序分析技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性检测的敏感性为87.5%,特异性为96.97%。由此可知,初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。用DNA测序分析结核分枝杆菌Rpsl基因和rrs基因链霉素耐药相关突变,判断结核杆菌链霉素耐药性具有较好的灵敏度和特异性,耗时短,在链霉素耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

健康人外周血中A20基因3'UTR突变与多态性分析

目的:建立检测NF-κB负调控因子A20基因3'非编码区(3'UTR)单核苷酸多态性(SNP)和突变的方法和rs77191406的检测方法.方法:利用PCR扩增99名健康人外周血单个核细胞(PBMCs)DNA的A20基因3'UTR全长片段,并对PCR产物进行核苷酸序列分析.将所测A20 3'UTR序列与Gen Bank中的序列(NM_006290.3)通过BLAST程序对比,检出可能存在的基因突变.利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测A20基因SNP rs77191406位点多态性.结果:在A20 3'UTR mRNA 3080位点检测出CT突变,该突变在基因库中已有作为SNP登记(rs77191406),该SNP在7例(7.07%)健康人样本中检测到,但并未发现其他突变和多态性.成功建立PCR-RFLP检测A20基因SNP(rs77191406)的方法.结论:首次报道中国健康人群中A20基因3'UTR存在rs77191406,其意义有待进一步明确.     

FASAY技术在肝癌p53基因功能突变检测中的应用

酵母中分离的等位基因功能分析技术(functional analysis of separated alleles in yeast,FASAY)是一种检测基因结构与功能关系的有效方法.利用FASAY技术结合DNA测序对28例临床原发性肝细胞癌手术样本中的p53基因结构突变与P53蛋白的功能进行了检测.结果发现在这些肝癌组织样本中,FASAY检测的阳性结果为15例,p53基因突变率为53.6%.cDNA测序的结果表明15例FASAY阳性样本均发生了p53基因突变,而13例FASAY阴性样本中未检测到基因突变.在15例p53基因突变肝癌样本中,有8例249位密码子突变,其中包括一例首次报道的249Thr双点突变(GC746.GC747→CG746.TA747),其余均为249Ser突变.研究结果表明,FASAY是一种灵敏的检测HCC中的p53基因结构与功能突变的技术,它可推广应用于肝癌临床样本的研究.     

云南妇女卵巢癌中p21WAF基因有较高的31位密码(Ser/Arg)突变

 通过PCR-SSCP分析和序列分析,对取自云南地区的44例妇女卵巢肿瘤样本的p21^WAF基因Ser³¹密码子的突变进行了分析.结果表明35例恶性肿瘤样本中有15例发现有突变,突变率为42.9%;9例良性肿瘤中有4例出现突变,突变频率44.4%;在另外6例正常组织中出现1例突变,突变率为16.7%.这一结果表明,云南妇女在这一基因位点存在多态性,这一位点的突变具有发生卵巢癌的趋势.     

人锰超氧化物歧化酶hSOD2-Q46K突变体的表达与功能分析

目的:构建人锰超氧化物歧化酶(hSOD2)-Q46K突变体,简化获得hSOD2突变体的步骤,探讨hSOD2结构与功能的关系.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)体外定点突变技术将hSOD2的46位Q氨基酸突变为K氨基酸,经测序鉴定正确后将p ET15b-hSOD2-Q46K突变体重组质粒转化Rosetta-gami大肠杆菌,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达.利用SWISS-MODEL Workspace对hSOD2-Q46K突变体进行同源建模,利用Swiss-Pdb-Viewer软件对建模结果进行分析.利用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白后用超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒检测目的蛋白的SOD活力.利用浓度为0.1 mmol/L百草枯(PQ)压力下生长情况测定表达hSOD2-Q46K和hSOD2蛋白的Rosetta-gami大肠杆菌的抗氧化能力.结果:测序结果表明46位密码子已由CAG突变为AAG.经过IPTG诱导后野生型和突变体均能表达出大小约为25 k Da的蛋白.SOD活性检测表明hSOD2-Q46K突变体的活力为899 U/mg,比野生型蛋白活性下降了65.4%.三维结构分析显示,突变点周围氨基酸间氢键被部分打破.结论:成功构建hSOD2-Q46K突变体并成功得到了纯化的突变体蛋白,hSOD2-Q46K的SOD活力比野生型降低了65.4%,且百草枯压力下表达hSOD2-Q46K蛋白的大肠杆菌A600达到0.84,而野生型蛋白的大肠杆菌A600达到1.14.这可能是因为突变点与周围氨基酸间氢键打破,突变点周围失去了原来的稳定结构,底物通道入口处氨基酸排列疏散,影响电子在氨基酸间的传递,影响静电导向机制,从而阻碍氧自由基在底物通道的通行,使hSOD2的催化活力下降.     

三种海藻凝集素对刺参组织免疫酶SOD、PO活性的影响

在基础饲料中分别添加质量分数为0.90%、1.80%、3.60%的裙带菜凝集素,1.36%、2.73%、5.45%的孔石莼凝集素,0.47%、0.94%、1.88%的萱藻凝集素,以基础饲料组为对照组,于投喂后第5、10、15、20天检测超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)活性.结果显示,各实验组的SOD、PO活性与对照组比较均有提高,且与对照组有显著性差异(P<0.05)和极显著差异(P<0.01).投喂1.80%质量浓度裙带菜凝集素组、1.36%质量浓度孔石莼凝集素组、1.88%质量浓度萱藻凝集素组效果最佳.海藻凝集素可作为刺参免疫增强剂使用,建议其适宜添加量为:1.80%裙带菜凝集素、1.36%孔石莼凝集素和1.88%萱藻凝集素.     

32例肿瘤组织中p53基因突变的PCR-SSCP、银染色检测

目的　检测肿瘤组织中 p5 3基因的突变率 ,探索其在肿瘤发展过程中的作用 .建立PCR SSCP检测 p5 3突变的常规方法 .方法　检测 32例癌组织和癌旁组织 .用盐沉淀制备样品DNA ,以p5 3基因exon7设计引物 ,用PCR SSCP结合银染色显示结果 .结果　 32例肿瘤标本检出阳性 9例 ,阳性率 2 8.1% .4例癌组织和癌旁组织均为阳性 .其中 2 2例胃癌 ,检出 4例阳性 (占 18.2 % ) ,双阳性者 2例 .结论　p5 3基因突变在肿瘤中具有普遍性 ,癌组织和癌旁组织双阳性者 ,与肿瘤的扩散有关 .该检测方法简便易行 ,有助于对 p5 3基因突变的扫描检测 .     

ANLL中转录因子GATA—2基因点突变

了解转录因子ＧＡＴＡ－２基因在ＡＮＬＬ中的表达和突变情况,方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ检测８５例ＡＮＬＬ病人外周血单个核细胞中ＧＡＴＡ－２基因的表达情况,ＰＣＲ产物进一步经单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析以了解基因突变情况。结果：绝大多数ＡＮＬＬ都表达了ＧＡＴＡ－２基因（８９．４％）,ＳＳＣＰ分析发现一例Ｍ２型的ＰＣＲ产物出现异常迁移带,核苷序列分析显示在ＧＡＴＡ－２基因第８９２位的核苷酸出现点突变,即第     

137 Cs-γ 辐照对实验红鲫 AFLP 多态性的影响

摘要:目的 观察137 Cs-γ 辐照对实验红鲫 AFLP 的变化,探讨不同剂量137 Cs-γ 辐照对实验红鲫 DNA 多态性的影响。 方法 根据前期实验结果,将实验红鲫 C1HD 系随机分为 5 组,10 尾 / 组,即空白对照组、1 / 16 LD50 、1 / 8 LD50 、1 / 4 LD50 、1 / 2 LD504 个辐照组,设置 1. 94 Gy、3. 88 Gy、7. 76 Gy、15. 53 Gy4 个辐照剂量组和一个空白对照组,用生物辐照仪对实验红鲫进行一次性辐照。 提取辐照前和辐照后的实验红鲫血液 DNA,经 AFLP-PCR 扩增,并进行多态性信息含量( PIC) 、基因杂合度( H) 、香农信息指数( I) 分析。 结果 实验红鲫在137 Cs-γ 辐照处理前的 PIC、H 和 I分别为 45. 20% 、0. 19 和 0. 28,经137 Cs-γ 辐 照 处 理 后 分 别 为 72. 27% 、0. 28 和 0. 41,且 遗 传 学 指 数 升 高。 结 论经137 Cs-γ 辐照处理后,实验红鲫的 AFLP 多态性信息含量增加,基因杂合度升高。 AFLP 标记实验红鲫 C1HD 系可用于监测核辐射污染。     

An amino-acid substitution involved in phenylketonuria is in linkage disequilibrium with DNA haplotype 2

Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive human genetic disorder caused by a deficiency of hepatic phenylalanine hydroxylase (PAH, phenylalanine 4-monooxygenase, EC 1.14.16.1). PKU is a common inborn error of amino-acid metabolism in caucasian populations and approximately 1 in 50 individuals are carriers of a PKU allele. To define the molecular basis of PKU, we characterized twelve restriction fragment-length polymorphism (RFLP) haplotypes of the PAH locus in the northern European population and observed that 90% of the PKU alleles in this population are confined to four common RFLP haplotypes. We have recently reported a splicing mutation in the PAH gene that is associated with RFLP haplotype 3 which is present at about 40% of mutant alleles. We now report the molecular lesion associated with the RFLP haplotype 2 mutant allele. This defect is caused by a C-to-T transition in exon 12 resulting in an amino-acid substitution (Arg to Trp) at residue 408 of PAH. Direct hybridization analysis of the point mutation using a specific oligonucleotide probe demonstrated that this mutation is also in linkage disequilibrium with RFLP haplotype 2 alleles that make up about 20% of mutant PAH genes.     

原发性肝癌P53基因第249密码子突变的研究

用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）技术对７例原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）进行Ｐ＾５３基因第２４９密码子突变的检测。结果：７例肝细胞癌中３例有Ｐ＾５３基因第２４９密码子突变，突变率达４２．９％。     

耳聋基因GJB2的突变分析及其与临床相关性的研究

为了研究苏州地区耳聋人群中GJB2基因突变的频率、突变类型及这些突变与耳聋发生的相关性,收集苏州地区散发性耳聋患者样本106例,家系32个(父母和患儿),听力正常对照组样本100例,PCR-直接测序法分析GJB2基因的突变,PCR-RFLP方法对明确有235delC突变的家系作进一步分析.结果显示:106例散发性耳聋患者中发现了11种变异,235delC是最主要的突变,其中18例为235delC纯合性缺失.235delC纯合突变导致常染色体隐性遗传性耳聋,患者多为双耳重深度耳聋(双耳大于90 dB),发病年龄早;235delc和其他位于不同染色体上的突变形成双重杂合性突变时,也可以导致耳聋.PCR-RFLP方法可在明确235delC突变的患者家系中进行基因诊断.     

BMP15基因和BMPR-IB基因与乐至黑山羊繁殖性状之间关系的初步研究

为了研究BMP15基因和BMPR-IB基因多态性与乐至黑山羊繁殖性状的关系, 采用PCR-RFLP方法, 对20只高产羔率、15只低产羔率乐至黑山羊的BMP15基因的FecXH突变和BMP-IB基因的FecB突变的多态性进行初步研究分析. 初步研究结果表明, 乐至黑山羊BMP15基因和BMP-IB基因都只存在一种基因型, 说明了BMP15基因的FecXH突变和BMP-IB基因的FecB突变不能作为乐至黑山羊多胎性状的候选基因, 其原因有待进一步研究和探索.     

KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变与转移性结直肠癌的关系

 为了联合检测并分析KRAS、BRAF和PIK3CA突变与临床病理指标之间的关系,探讨基因突变在结直肠癌(CRC)发生、发展中的生物学意义,收集第四军医大学西京消化病医院及兰州军区兰州总医院2008—2009年入院治疗的150例结直肠癌患者的癌组织标本,提取DNA行PCR扩增后,采用焦磷酸测序法联合检测KRAS、BRAF及PIK3CA基因的突变率,统计分析基因突变与患者临床病理(包括患者的年龄、性别、肿瘤位置、Dukes'分期、TNM分期、组织病理学分型及转移)之间的关系。结果表明,在150例患者中,KRAS突变率为32%(48/150),BRAF突变率为8%(12/150),PIK3CA突变突变率为12%(18/150),其中9号外显子突变率为6%(9/150),20号外显子突变率为6%(9/150)。KRAS和PIK3CA的突变与患者的Dukes'分期关系密切,KRAS、BRAF和PIK3CA的突变与CRC患者的年龄、性别、肿瘤位置、组织病理学分型之间无明显的关系。     

应用DHPLC检测多巴胺D2受体基因在中国人群中的多态性

通过变性高效液相色谱 (DHPLC)和DNA测序在 4 1个中国汉族人DNA样本中检测DRD2基因编码区和拼接区的单核苷酸多态性 (SNP) ,结果发现 3个SNP :Intron5的 2 77G/A、Exon7的 4 2C/T和Exon7的 1 2 9T/C .Intron5 2 77G/A是在中国汉族人群中发现的新SNP ,Exon7 4 2C/T和 1 2 9T/C在NCBIdbSNP中已有相应记录 (分别为rs4 986 92 1和rs6 2 75) ,它们均导致DRD2基因的同义突变 ,其中Exon7 1 2 9C等位基因频率在研究样本中高达 4 3.9% .这些结果为在中国汉族人群中开展DRD2基因相关的群体遗传学研究提供了遗传标记 .另外 ,还探讨了DHPLC检测突变的干扰因素及控制措施 ,为国内同行开展类似工作提供参考