油葵油脂合成关键酶基因DGAT2的克隆及烟草遗传转化

为了研究油葵DGAT2基因的功能,利用RT-PCR结合RACE技术,从"新葵杂5号"未成熟种子中克隆了1个二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT)基因HaDGAT2。分析表明该基因cDNA全长1387 bp(GenBank登录号为HQ248185),包含993 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸;氨基酸比对表明该基因编码产物与其他植物DGAT2蛋白序列的相似性较高(66%-71%);进化树分析表明HaDGAT2与油桐和蓖麻DGAT2亲缘关系较近,并与蒺藜苜蓿、拟南芥、油菜等植物聚为一支;半定量RT-PCR分析显示,HaDGAT2在油葵根、叶、花和未成熟种子中均有表达,且在未成熟种子中表达量最高。在烟草中过量表达HaDGAT2基因能提高烟草叶片含油量以及油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)的含量,推测HaDGAT2在调控TAG的积累过程中起关键作用。     

苦荞CCT基因家族生物信息学及表达分析

CCT转录因子在调控植物花期、生长发育及抗非生物胁迫等方面发挥着重要的功能。本研究以拟南芥AtCCT基因家族为参考序列,利用本地BLAST并结合保守结构域等生物信息学工具,筛选出苦荞FtCCT基因家族成员,并对其理化性质、染色体分布、基因结构、系统进化及表达水平进行分析。结果显示:从苦荞中共鉴定出35个FtCCT基因,含1-8个内含子;编码蛋白有117-753个氨基酸残基,等电点为4.96-9.51,均为亲水性蛋白。染色体定位分析表明,这些基因在8条染色体上均有分布。苦荞FtCCT基因家族含有10个保守基序和5个保守结构域,且都含有CCT保守结构域。系统进化分析表明,苦荞的FtCCT基因家族与拟南芥一样可分为3个亚家族,其中CMF亚家族的成员最多。35个FtCCT基因在苦荞根、茎、叶和花中的表达水平具有差异性,在叶和花中具有高表达量的成员较多,只有少数的成员在根和茎中高表达。本研究为进一步解析CCT基因调控苦荞花期及生长发育奠定基础。     

小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

水稻OsICK1基因克隆及其序列分析

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK)是一种能够影响细胞生长和发育的重要调控蛋白.以水稻(9311)为材料,利用RT-PCR技术,扩增获得了1个新的可能为水稻细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因,命名为OsICK1.核苷酸序列分析表明,该基因的开放阅读框为585 bp,编码194个氨基酸.与Genbank中预测的水稻ICK基因序列(NM_196964)比对,两者同源性为79.84%;氨基酸序列分析表明,该基因氨基酸序列3′端附近存在植物ICK所固有的保守序列,与玉米ICK1保守序列的同源性高达95.5%.     

眼斑拟石首鱼肽聚糖识别蛋白2的基因克隆与组织表达特性

采用同源克隆技术获得了眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)的肽聚糖识别蛋白2基因(命名为So-pglyrp2).So-pglyrp2的cDNA全长1 729 bp,含有1个1 446 bp的开放阅读框,编码的482 aa前体蛋白带有1个21 aa信号肽;So-pglyrp2基因由4个外显子和3个内含子构成.序列比对分析表明,So-pglyrp2存在1个保守的PGRP结构域,其氨基酸序列与已报道的脊椎动物pglyrp2的同源性最高,一致性为57.1%~82.8%.RT-PCR分析表明,So-pglyrp2基因在肝脏强烈表达,在性腺、肠和胃组织弱表达,在其他组织不表达.研究结果为阐明鱼类pglyrp2基因结构、了解低等脊椎动物pglyrp2的进化地位、探讨鱼类pglyrp2的免疫学功能奠定了坚实的基础.     

甘蓝型油菜Tic21基因克隆、表达及拷贝数鉴定

根据拟南芥Tic21基因编码区设计引物,在甘蓝型油菜中扩增并克隆到其cDNA同源基因,命名为BnTic21(GenBank登录号HQ613273),测序结果显示该基因含有5个外显子,4个内含子,cDNA编码区大小为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白理论分子量约为31.24kD,等电点11.10.与拟南芥、豌豆等物种氨基酸序列相似性在60.40%～87.75%之间.实时定量PCR对其不同组织特异性表达分析表明:BnTic21在油菜不同部位均有表达,茎尖最高,子叶、真叶、下胚轴次之,根表达量最低.用实时定量PCR检测表明BnTic21在甘蓝型油菜基因组中约有2个拷贝.     

棉花GhRGPL2基因分离鉴定及其在组织发育和逆境胁迫中的表达调节

在棉花cDNA文库中分离了1个RGP蛋白基因同源序列,命名为GhRGPL2,编码含有359个氨基酸的RGP蛋白.随后,分离获得GhRGPL2基因全序列,基因结构分析表明:它含有3个内含子,分别位于第106和107密码子之间,第190个密码子内部,第246和247密码子之间.Northern杂交分析表明.GhRGPL2在幼根和胚珠中表达量较高.而且,该基因的表达受胚珠发育调节.GhRGPL2基因在胚珠发育早期开始表达,在开花后10 d达到表达峰值,随后基因表达活性逐渐下降.在高盐和干旱胁迫下,GhRGPL2在棉花幼根中的表达量升高.     

沙冬青AmDREB1F基因的克隆与表达载体构建

DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子在植物耐逆性中起重要作用.利用RNA-Seq技术从蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中鉴定出一个受低温和干旱强烈诱导的DREB基因,并用PCR方法克隆到其完整编码区的cDNA和gDNA.二者均由726bp组成,故无内含子.推测其蛋白产物含241个氨基酸残基和1个保守的AP2结构域及核定位信号,很可能定位于细胞核.因为与拟南芥等植物DREB1F蛋白同源性较高,故将该基因命名为AmDREB1F.将其编码区cDNA片段成功构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,为进一步研究其功能奠定了基础.     

人spindlin 1基因全长cDNA的克隆与定位

利用分子克隆技术和生物信息学手段,克隆并命名了人spindlin 1 基因. 此基因cDNA全长4375?bp,含有236～949 bp完整开放读框,预测编码27?ku 的膜内蛋白. 新基因在核酸序列上与鼠spindlin基因有96%同源,其编码氨基酸序列与鼠spindlin蛋白98%同源. 生物信息学分析表明该基因定位于9q22.1-22.3 区域, 基因组DNA全长为52.3?kb,由5个外显子和4个内含子组成,内含子和外显子之间的剪切完全符合GT-AG法则. 利用绿色荧光蛋白与spindlin 1基因的融合蛋白表达载体转染COS-7细胞表明spindlin 1表达的蛋白定位于胞核,且转染后的细胞中较多见胞核形态的改变,例如出现双核或巨型核.     

党参CpSUC4基因全长克隆及表达分析

蔗糖为党参多糖合成的重要前体物质,而其在植物体内的转运主要通过蔗糖转运蛋白(sucrose/H+cotransporter,SUC)来完成,但是SUC与多糖合成的关系尚不清楚。文章根据党参转录组数据克隆得到党参SUC(CpSUC4)基因全长,并通过生物信息学、原核表达及qRT-PCR技术分析CpSUC4基因表达与党参多糖合成之间的相关性。结果表明,克隆所得CpSUC4基因全长1 488bp,编码495个氨基酸,预测定位于液泡中,原核表达分析显示CpSUC4融合蛋白大小约为60kDa,其与菊科向日葵、菊苣、莴苣亲缘关系较近。在党参根系、花组织中党参多糖含量及CpSUC4基因表达量均显著高于叶。表明本研究克隆得到的CpSUC4基因的表达与党参多糖合成具有一定的相关性。     

毛竹PeSCL6基因的克隆及其表达分析

SCL6基因是植物保持茎端分生组织未分生状态所必需的关键基因之一。采用RT-PCR和RACE方法从毛竹(Phyllostachys edulis Carr.)中获得一个SCL6同源基因,命名为PeSCL6。该基因全长1 894 bp,其中5'端非编码区60 bp,3'端非编码区211 bp,编码区1 623 bp,共编码540个氨基酸。序列分析表明:PeSCL6基因编码的蛋白含有LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW 5个保守区,属于GRAS家族蛋白; 该蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的SCL6有较高的一致性(70%以上)。实时定量PCR结果表明:PeSCL6基因为组成型表达,且在叶片中的表达丰度最高; 而在即将开花之前和处于盛花期的竹株叶片中PeSCL6表达丰度明显降低,分别为幼龄竹株叶片的1%和14%。PeSCL6基因表达的变化,意味着它可能参与毛竹由营养生长向生殖生长的转换调控。     

3个荞麦物种中种子蛋白相关基因的表达分析

以甜荞、苦荞、金荞为研究材料,利用生物信息学在荞麦转录组数据中鉴定种子蛋白相关基因,结果一共鉴定21个种子蛋白相关基因,通过PCR技术可以成功扩增出20个基因,其中包含1个13S球蛋白基因(Unigene.10815),1个11S球蛋白基因(Unigene.34090)和1个谷蛋白基因(Unigene.39749)。利用荧光定量PCR技术鉴定这些基因在甜荞、苦荞和金荞种子发育不同时期的表达情况。结果表明,不同基因在同一材料不同时期的表达情况不同,同一基因在同一时期不同材料中的表达情况也不同。     

丹参COR413基因克隆及表达分析

从丹参EST数据库筛选出一条与冷调节基因(cold-regulated gene,COR)家族同源性较高的基因序列,并利用PCR方法得到该基因的DNA序列,命名为SmCOR413.该基因DNA序列长1708 bp,包含4个外显子和3个内含子,编码171个氨基酸,与其他9种植物中的COR413高度相似,相似性介于66%~78%之间,推测为COR413基因家族的一个新基因.生物信息学分析表明,SmCOR413所编码蛋白的分子量为19.77 kD,理论等电点为8.95,不具备信号肽.实时定量PCR检测的结果显示,SmCOR413在丹参根、茎和叶中都有表达,在叶、茎中表达量较高,根部的表达量最低.     

大黄鱼cyclin B1和cdc2 cDNA序列特征及组织表达分析

成熟促进因子(MPF)是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子,在配子成熟过程中具有重要作用.MPF由周期蛋白B(cyclin B,CB)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK1,由cdc2基因编码)2个亚基组成.本研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)cyclin B1(Lc-cb1)和cdc2(Lc-cdc2)基因的cDNA序列,并分析了这2个基因mRNA的组织表达特征,为解析MPF在大黄鱼性腺发育和配子成熟的作用机理奠定基础.Lc-cb1基因全长cDNA 1 882bp,可编码397个氨基酸的蛋白;Lc-cdc2基因全长cDNA序列1 151bp,可编码303个氨基酸的蛋白.基于Lc-cb1 cDNA序列推导的氨基酸序列与6种脊椎动物的CB1氨基酸序列有较高相似性(67%~84%),并具有周期蛋白盒、毁坏盒、以及蛋白酶K位点(RRxSK)等CB预期特征.基于Lc-cdc2的cDNA序列推导的氨基酸序列也与其他6种鱼类的CDK1氨酸酸序列有较高相似性(88%~97%),并具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化结构域、ATP结合相关的保守序列(GxGxxGxV)、周期蛋白结合相关的PSTAIRE序列等CDK1的预期特征.可见,本研究克隆获得的2条序列是Lc-cb1和Lc-cdc2 cDNA全长.实时荧光定量PCR结果显示,Lc-cb1和Lc-cdc2的2个基因mRNA表达具有相似的组织特异性,在性腺中mRNA水平均远远高于其他组织,表明Lc-cb1和Lc-cdc2是大黄鱼性腺发育相关的重要基因.     

甘薯类胡萝卜素合成酶基因pds全长cDNA的克隆

根据双子叶植物类胡萝卜素合成结构基因氨基酸保守区域设计简并引物,扩增出甘薯编码类胡萝卜素合成关键酶PDS的基因(pds)cDNA中间片断。通过5'-RACE和3'-RACE技术进行cDNA末端的快速扩增,成功地克隆了pds的全长cDNA。序列分析表明,pds基因的全长cDNA序列长度为2128 bp,编码572个氨基酸,与其他植物的序列高度同源。     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3'端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基基因的克隆和表达分析

根据拟南芥等G蛋白β亚基基因的DNA序列,采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆了一个编码G蛋白β亚基基因的全长cDNA,命名为BnAGB1.BnAGB1含有1134 bp的完整开放阅读框,编码378个氨基酸,与其它植物的Gβ亚基氨基酸序列有很高的同源性,且具有保守的Gα、Gγ结合区域及WD-40结构域.对甘蓝型油菜矮化突变体及其野生型中不同组织和不同发育时期的BnAGB1表达进行实时定量PCR分析表明:BnAGB1在矮化突变体和野生型的各个组织中均有表达;在生长旺盛期的子叶期、抽薹期和荚果期有较高的表达,而在两片真叶期、四片真叶期和花期表达较低;而且,在所有分析的不同时期和组织中,矮化突变体中的表达均显著或极显著高于野生型.以上结果表明,BnAGB1参与了甘蓝型油菜的生长发育进程的调控,与油菜矮化突变性状表现可能相关.     

中华按蚊CYP4G17基因的鉴定及生物信息学分析

基于中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组,通过同源性搜索鉴定出一条中华按蚊CYP4家族序列,生物信息学分析将该基因命名为AsCYP4G17(GenBank登录号:KP004246),该序列全长1 962bp,其中编码区1 671bp,编码556个氨基酸。同源性分析表明该基因与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)CYP4G17氨基酸序列相似性最高:一致率为89%,相似率为94%。该基因编码的蛋白质相对分子质量为63.48kD,等电点为7.70。该蛋白第20~39位氨基酸为疏水区,蛋白质亚细胞定位显示该蛋白质位于细胞质中。基因结构分析显示,该基因含有两个相位2型内含子。研究结果为进一步揭示中华按蚊CYP4G17基因的功能奠定了基础,对阐明昆虫杀虫剂抗性机理具有一定的科学意义。     

粉尘螨Der f4基因的克隆和蛋白分子特征分析

从深圳地区采集粉尘螨纯培养,提取总RNA,根据香港中文大学合成的尘螨基因序列并设计的引物,RT-PCR扩增出Der f4基因,克隆到pUC57载体后测序和进行生物信息学分析.将该目的基因克隆到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET-28a-Der f4.用生物软件分析尘螨变应原Der f4序列. RT-PCR获得目的基因Der f4 cDNA全长为1593 bp.推测编码蛋白由526个氨基酸组成,生物信息学分析表明,Der f4具有多种磷酸化位点,含有信号肽,为疏水性蛋白,包含淀粉酶抑制剂功能结构域.获得Der f4基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有淀粉酶抑制剂活性.     

黑莓果实发育过程中蔗糖磷酸合成酶基因的表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖代谢合成的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面有重要作用。本研究旨在探讨黑莓3个SPS基因的系统发育关系、编码的蛋白特性、在不同发育时期、不同组织中的时空表达特性,并分析其与黑莓发育的关系。【方法】以黑莓栽培品种‘宝森’(‘Boysenberry’)为试材,从中克隆和鉴定了3个 SPS 基因家族成员,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等方法对3个黑莓SPS 基因RuSPS1、RuSPS2和RuSPS3的氨基酸序列、保守作用元件、编码的蛋白特性、蛋白结构及进化关系进行分析,并对这3个基因在黑莓中的时空表达情况与酶活性进行了相关性分析。【结果】多重氨基酸序列比对显示,黑莓SPS蛋白具有植物SPS家族特有的2个保守蛋白结构域及2个相对保守的蛋白磷酸位点;系统进化分析表明,RuSPS基因分为A、B两个亚族,其中RuSPS1和RuSPS3为A亚族成员,RuSPS2为B亚族成员;保守作用元件分析表明, 除RuSPS2含基本的蛋白保守元件外, RuSPS1和RuSPS3都存在不同程度的片段缺失;序列分析和比较揭示了黑莓SPS基因与其他家族的不同特征。qRT-PCR分析显示,3个RuSPS基因在黑莓各个组织器官中均有表达,其中RuSPS1在叶片和果实中表达量较高,在花中的表达量较低;RuSPS2在发育成熟的果实中有大量的表达,在其他器官中表达量较低;RuSPS3在各器官中的表达均较高,说明 SPS基因表达具有明显的组织特异性,3个RuSPS基因都随着果实发育进程在果实和叶片中表现了表达增加的趋势。果实和叶片中SPS酶活性的变化与RuSPS基因表达水平一致。相关分析表明,叶片中SPS活性与RuSPS2显著正相关(P<0.05),果实中SPS活性与RuSPS1显著负相关(P<0.05)。【结论】3个RuSPS基因与黑莓果实发育过程中的蔗糖合成与代谢关系密切,均参与了黑莓的生长发育调控,其中叶片中SPS活性的变化一定程度上是由RuSPS2调控,果实中SPS活性的变化则是由RuSPS1调控。