Tet-off诱导表达CUEDC2稳定细胞系的建立

CUEDC2(CUE domain containging protein 2)是近年来发现的一个功能尚未十分明确的蛋白质。实验室前期的研究表明,CUEDC2通过影响孕激素受体PR抑制乳腺癌细胞生长。此外,研究还发现CUEDC2通过招募PP1磷酸酶,促进IKK复合体的去磷酸化,抑制NF-kB信号通路的激活。为了深入研究CUEDC2的功能,构建了CUED2可诱导表达载体(p617-neo-T-CUEDC2-I-tTA4),并通过逆转录病毒系统获得tet-off可诱导表达CUEDC2的稳定细胞系。该诱导表达细胞株的建立为CUEDC2功能基因的研究提供了必要的手段。     

CUEDC1的克隆表达及其对PRB和ERα转录活性的影响

为了研究CUE Domain Containing 1 (CUEDC1)蛋白质功能,构建了pcDNA3.0-Flag-CUEDC1表达载体,并且成功表达Flag-CUEDC1蛋白质.通过双荧光报告系统,对比CUEDC1与CUEDC2对PRB和ERα转录活性的影响.其结果显示,CUEDC2能够抑制PRB和ERα转录活性,而CUEDC1对PRB和ERα转录活性的影响不显著.     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

构建pcDNA5/FRT-SlSCP-2和阳性对照pcDNA5/FRT-GFP真核表达载体,将斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCP-2和绿色荧光蛋白GFP分别整合进入Flp-In~(TM)CHO细胞基因组中的FRT位点上,利用western blotting方法和荧光倒置显微镜观察鉴定SlSCP-2和GFP蛋白在CHO细胞的表达情况.结果表明,重组质粒瞬时转染CHO细胞24h后,pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP均能正确表达目的蛋白,SlSCP-2能够增加细胞对胆固醇的吸收.同时确定了筛选稳定转染细胞株合适的潮霉素浓度.     

CUEDC1抑制TNFalpha激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP—1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag—CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP—1信号通路的影响。结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP—1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP—1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平。     

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.     

CUEDC1抑制TNFα激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP-1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag-CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP-1信号通路的影响.结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP-1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP-1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平.     

慢病毒介导MCF-7细胞中FOXP2基因沉默体系的建立

为了实现FOXP2基因在MCF-7细胞中稳定低表达,采用基因工程的方法构建pMAGic7.1-shFOXP2慢病毒干扰载体,并将其与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装shFOXP2干扰慢病毒,收取病毒上清加入到MCF-7细胞中,培养48h,荧光定量PCR检测FOXP2的基因mRNA表达水平,Western Blotting检测FOXP2蛋白表达水平.获得了pMAGic7.1-shFOXP2干扰载体,从而成功建立FOXP2基因稳定干扰的MCF-7细胞株,为进一步研究FOXP2在乳腺癌发生发展中的功能提供了研究材料.     

Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠的制备

目的：建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型。方法：构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2mg/ml的多西环素（Doxycycline）诱导小鼠体内CUEDC2表达,通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果：经诱导,CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2, 并具有乳腺特异性。结论：Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功.     

人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系.     

应用流式细胞分选技术分离人外周血原代单核细胞

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,具有免疫调节、抗感染和抗肿瘤等重要功能。快速、有效地分离得到高纯度的人外周血单核细胞,是研究巨噬细胞功能的前提。本文利用细胞大小及胞内颗粒度属性对单核细胞与其他白细胞组分进行区分,通过流式细胞分选,获得了较高纯度单核细胞。单核细胞表面标志物CD14染色分析显示,该方法对单核细胞的分选效率达85%以上。进一步实验证明,分选得到的单核细胞能够在体外正常分化为巨噬细胞。     

树突状细胞在大鼠再生肝中分布及数量变化

探讨树突状细胞在大鼠再生肝中分布及数量变化,为深入研究其在肝再生进程中的作用奠定基础.制作大鼠2/3肝切除模型(PH),用两步灌流法分散肝脏细胞,用Percoll密度梯度离心和ox62免疫磁珠分离相结合方法分离树突状细胞(DC),用免疫组织化学方法定性、定位CD86和CD103在再生肝(RL)、分散的肝脏细胞及分离的树突状细胞中分布,用蛋白免疫印迹方法定量树突状细胞的CD86和CD103,用RT-PCR定量分离的树突状细胞CD86和CD103的mRNA.结果表明,0 h再生肝树突状细胞分布于肝血窦、中央静脉、胆管周围,12 h在远离中央静脉和胆管的部位出现,24 h呈弥散状分布,168 h分布与对照相同;从肝切除后0、2、6、12、24、30、36、72、120、168 h等10个时间点的大鼠再生肝中收获的树突状细胞平均数分别为每只大鼠1.55、1.59、1.87、2.46、1.49、2.73、3.87、6 04、6 52、8 40 百万个,CD86和CD103阳性细胞数目、细胞活性均在95%以上.上述结果说明在肝再生进程中树突状细胞的分布由肝血窦、中央静脉、胆管周围逐渐向全肝弥散,24 h弥散达到高峰,之后回落,至168 h分布与对照相同,但其数量随肝再生进程而增加.     

酸苯酚萃取总RNA方法的改进

目前提取总ＲＮＡ普遍使用的是酸苯酚萃取法（或称硫氰酸胍法）．此法所提取的ＲＮＡ中存有少量基因组ＤＮＡ的污染．为了克服这一缺点,我们对酸苯酚提取ＲＮＡ的方法进行了改进．即先用酸苯酚萃取,然后用蛋白酶Ｋ消化,再次酸苯酚萃取．用改进的方法提取的ＲＮＡ无基因组ＤＮＡ的污染     

小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型,试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。先采用机械分离方法分离子宫平滑肌,再用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法消化,可获得90%以上具有正常代谢活性的小鼠子宫平滑肌细胞,存活的细胞经倒置显微镜观察和免疫荧光染色进行鉴定。原代培养3d后细胞贴壁生长,约2周后细胞汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,平滑肌细胞肌动蛋白(α-Actin)免疫荧光染色强阳性。采用本法体外培养的小鼠子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于小鼠子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。     

CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis

Macrophages, which are abundant in the tumour microenvironment, enhance malignancy. At metastatic sites, a distinct population of metastasis-associated macrophages promotes the extravasation, seeding and persistent growth of tumour cells. Here we define the origin of these macrophages by showing that Gr1-positive inflammatory monocytes are preferentially recruited to pulmonary metastases but not to primary mammary tumours in mice. This process also occurs for human inflammatory monocytes in pulmonary metastases of human breast cancer cells. The recruitment of these inflammatory monocytes, which express CCR2 (the receptor for chemokine CCL2), as well as the subsequent recruitment of metastasis-associated macrophages and their interaction with metastasizing tumour cells, is dependent on CCL2 synthesized by both the tumour and the stroma. Inhibition of CCL2-CCR2 signalling blocks the recruitment of inflammatory monocytes, inhibits metastasis in vivo and prolongs the survival of tumour-bearing mice. Depletion of tumour-cell-derived CCL2 also inhibits metastatic seeding. Inflammatory monocytes promote the extravasation of tumour cells in a process that requires monocyte-derived vascular endothelial growth factor. CCL2 expression and macrophage infiltration are correlated with poor prognosis and metastatic disease in human breast cancer. Our data provide the mechanistic link between these two clinical associations and indicate new therapeutic targets for treating metastatic breast cancer.     

两种球形棕囊藻细胞总RNA提取方法的比较

不同植物细胞RNA提取的适宜方法各不相同.本实验分析、比较了QIAGEN试剂盒法和西曲溴铵(CTAB)法用于赤潮藻细胞总RNA提取的情况.结果显示,两种方法均可获得高质量的总RNA.比较而言,CTAB法比QIAGEN试剂盒更可取,适合藻细胞RNA的大量提取.     

Complementation in monocyte hybrids revealing genetic heterogeneity in chronic granulomatous disease

Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare syndrome, found predominantly in male children and characterized by life-threatening, recurrent infections. The superoxide (O2-)/hydrogen peroxide (H2O2) generating system in the granulocytes and monocytes of CGD patients is completely defective. Furthermore, a novel type of cytochrome b, detected by the optical spectrum of phagocytes from healthy subjects, is lacking in those of most male CGD patients. In female CGD patients, the cytochrome b is present, but cannot, as in normal cells, be reduced on metabolic stimulation of the phagocytes in anaerobic conditions. Here, to demonstrate the importance of cytochrome b in this system and to investigate the genetic background of the various forms of CGD, we have hybridized monocytes from a cytochrome b negative, X-linked male CGD patient with monocytes from a cytochrome b positive, male CGD patient with unknown genetic background. Monocytes were used because they are the only blood phagocytes that show an active protein synthesis, whereas fibroblasts or lymphocytes do not express the O2-/H2O2 generating system. The heterologous hybrids were positive in the nitroblue tetrazolium (NBT) slide test, indicating the complementation of the O2-/H2O2 generating system, whereas the homologous hybrids remained negative, as did the non-fused cells of these patients. We thus conclude that cytochrome b is part of the O2-/H2O2 generating system and that somatic cell hybridization experiments with monocytes provide a means of studying the genetic background of CGD patients. We believe this to be the first report of genetic complementation by somatic cell hybridization experiments using monocytes instead of fibroblasts.     

白细胞的自动识别和分类

白细胞的分类目前已成为医院的常规检查项目之一,检查结果对于临床诊断有着十分重要的意义。然而,显微镜下的这项工作是十分耗时的,且不同的检验人员有着不同的分类误差。为此,本文初步探讨了用图象处理和模式识别的方法对白细胞进行自动识别和分类,希望能以计算机来帮助人的眼脑系统,从而减轻检验人员的工作强度,提高分类的效率和一致性。本文运用了图象处理手段,用求熵阈值法对细胞图象进行分割,提取细胞及细胞核;用全向跟踪法提取细胞轮廓和核轮廓,同时,提出了一种快速的区域生长算法对轮廓内区域作填充。本文对每幅细胞图象提取了一个五维的特征向量,采用多两类分类和留一法,对有限的样本作训练,以设计Bayes分类器,对白细胞逐层分类,并对分类效果作出检验。本文通过以上方法的应用,白细胞的分类取得了比较好的结果。     

白细胞的自动识别和分类

白细胞的分类目前已成为医院的常规检查项目之一,检查结果对于临床诊断有着十分重要的意义.然而,显微镜下的这项工作是十分耗时的,且不同的检验人员有着不同的分类误差.为此,本文初步探讨了用图象处理和模式识别的方法对白细胞进行自动识别和分类,希望能以计算机来帮助人的眼脑系统,从而减轻检验人员的工作强度,提高分类的效率和一致性. 本文运用了图象处理手段,用求熵阈值法对细胞图象进行分割,提取细胞及细胞核;用全向跟踪法提取细胞轮廓和核轮廓,同时,提出了一种快速的区域生长算法对轮廓内区域作填充.本文对每幅细胞图象提取了一个五维的特征向量,采用多两类分类和留一法,对有限的样本作训练,以设计Bayes分类器,对白细胞逐层分类,并对分类效果作出检验. 本文通过以上方法的应用,白细胞的分类取得了比较好的结果.     

Absence of expression of OKT8 antigen on cultured human, calf and rat oligodendrocytes

Monoclonal antibodies which recognize human suppressor T cells (OKT8) have been reported by Oger and co-workers to bind to cultured sheep oligodendrocytes. These authors speculated that an immune response directed at determinants shared by suppressor lymphocytes and oligodendrocytes could explain the decrease in both circulating blood suppressor T cells and oligodendrocytes in patients with multiple sclerosis. In view of the vital issue of potential cross-reactivity between oligodendrocytes and lymphocytes, we studied the binding of viable cultured calf, rat and human oligodendrocytes using monoclonal antibodies to human T cells and monocytes. We report here that we were unable to confirm the presence of shared determinants among oligodendrocytes and any leukocytes, including human T cells or monocytes. As the reported observations of lymphocyte-oligodendrocyte shared determinants could not be identified in three other species, including man, we found no evidence to support the hypothesis that such shared determinants are of importance in the pathogenesis of multiple sclerosis.