CUEDC1抑制TNFα激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP-1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag-CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP-1信号通路的影响.结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP-1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP-1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平.     

CUEDC1抑制TNFalpha激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP—1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag—CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP—1信号通路的影响。结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP—1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP—1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平。     

CUEDC1氨基酸保守性分析及抑制TGF-beta /Smad转录活性

为了分析CUEDC1氨基酸保守性和研究CUEDC1蛋白质影响TGF-beta/SMAD信号通路的转录活性,用软件分析比较CUEDC1的氨基酸序列和通过双荧光报告系统测定TGF-beta/SMAD转录活性。结果显示cue结构域在人、小鼠和大鼠之间相似性为100%和过表达CUEDC1能够抑制TGF-beta/SMAD转录活性。     

逆转录病毒感染结合流式细胞分选方法构建稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系

CUEDC2（CUE domain containing protein 2）是本实验室发现的功能未知蛋白质。已有研究证明CUEDC2通过抑制孕激素受体PR影响乳腺癌细胞的生长,同时CUEDC2的高表达能够降解雌激素受体ER而导致乳腺癌内分泌治疗耐药。为了深入研究CUEDC2在乳腺癌中的功能,我们构建了稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系。利用逆转录病毒将非融合形式的绿色荧光蛋白质GFP和CUEDC2基因稳定整合至靶细胞的基因组中,经过流式分选获得GFP阳性细胞,即为稳定表达CUEDC2的细胞株。上述方法高效快捷,极大提高了稳定细胞株的构建效率。同时该稳定细胞株的建立为CUEDC2的功能研究提供了必要的工具。     

内分泌干扰物对雌激素受体信号通路的影响

内分泌干扰物(endocrine disruptive chemicals,EDCs)可通过干扰雌激素受体(ER)信号通路影响相关转录活动.在阐述ERα和β两个亚型的基本结构特征和其信号转导途径的基础上,重点回顾近年来关于EDCs对ER信号转导通路干扰机制的研究进展.EDCs对ER信号通路的干扰机制包括配体依赖和非依赖两种,配体依赖机制分为直接作用和间接作用.直接作用的机制是EDCs可作为配体与雌激素竞争ER上的结合位点,从而影响ER的促转录活性.间接作用机制的研究热点集中在芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR),EDCs作为配体可激活AhR,而AhR能够促进ER蛋白泛素化并降解,也可通过与ER竞争辅助激活因子或直接影响ER介导的DNA转录.EDCs通过非配体依赖以及非基因组途径干扰机体的内分泌活动的机制目前仍不清楚,提示未来需注重研究EDCs对多种信号通路的影响.     

新型雌激素受体ERα36在张氏肝细胞和人肝癌细胞中的表达比较分析

研究新型雌激素受体ERα36在人肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达具有重要的意义.以张氏肝(Chang Liv-er)、Caveolin-1基因沉默细胞株CAV7、人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2为实验材料,通过免疫印迹杂交法观察了不同细胞内ERα36蛋白的表达情况,并与典型雌激素受体亚型ERα66蛋白的表达进行了比较.结果发现:(1)几种细胞中均有ERα36蛋白的表达;(2)与张氏肝细胞相比,Caveolin-1基因沉默时ERα36表达明显增加(P0.01);(3)ERα36在SMMC-7721中表达水平较低,而在HepG2细胞中表达水平较高,与ERα66和Caveolin-1的表达水平相关.提示新型雌激素受体ERα36可能参与Caveolin-1介导的雌激素信号转导,而在肝细胞的恶性增殖过程中发挥一定的作用.     

Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠的制备

目的：建立Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠模型。方法：构建转基因表达载体,经细胞诱导表达验证后,酶切得到含有CUEDC2的线性DNA片段,并采用显微注射的方法及后续筛选鉴定,得到CUEDC2转基因小鼠。进而通过与乳腺特异表达的MMTV-rtTA转基因小鼠交配,得到CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。利用2mg/ml的多西环素（Doxycycline）诱导小鼠体内CUEDC2表达,通过Western Blot、免疫组化检测表达。结果：经诱导,CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠的2个Founder的F1、F2代在转录水平和蛋白水平均成功表达CUEDC2, 并具有乳腺特异性。结论：Tet-on系统诱导乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠制备成功.     

PPARα活化增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性的机制

 研究探索EGCG是否调节PPARα以及PPARα活化对EGCG的肿瘤抑制作用影响及其机制。首先利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,之后分别采用western blotting和real-time PCR检测蛋白质和mRNA表达水平;采用PPARα的特异性激动剂和特异性拮抗剂来改变PPARα的表达;应用荧光素酶报告基因系统及染色质免疫共沉淀研究PPARα对HO-1的调控。结果表明,随着EGCG浓度的增加,PANC1和A2780细胞的存活率逐渐下降。当EGCG处理肿瘤细胞后,PPARα蛋白水平会随着EGCG剂量的提高而增加。PPARα的特异性激动剂—氯贝特(clofibrate)能增加胰腺癌PANC1和卵巢癌A2780细胞对EGCG的敏感性,其机制是氯贝特能够抑制细胞保护性血红素加氧酶-1(HO-1)的诱导。荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验(ChIP)表明,活化的PPARα能结合到HO-1启动子上的PPAR结合元件(PPRE)上并抑制HO-1的表达。研究表明,PPARα的活化能在转录水平对HO-1进行负调控,同时增加肿瘤细胞对EGCG的敏感性。     

Tet-off诱导表达CUEDC2稳定细胞系的建立

CUEDC2(CUE domain containging protein 2)是近年来发现的一个功能尚未十分明确的蛋白质。实验室前期的研究表明,CUEDC2通过影响孕激素受体PR抑制乳腺癌细胞生长。此外,研究还发现CUEDC2通过招募PP1磷酸酶,促进IKK复合体的去磷酸化,抑制NF-kB信号通路的激活。为了深入研究CUEDC2的功能,构建了CUED2可诱导表达载体(p617-neo-T-CUEDC2-I-tTA4),并通过逆转录病毒系统获得tet-off可诱导表达CUEDC2的稳定细胞系。该诱导表达细胞株的建立为CUEDC2功能基因的研究提供了必要的手段。     

用体外转录法制备小干扰RNA抑制Hela细胞CUEDC2基因表达

CUEDC2是一个广泛表达于各种真核生物、功能尚不明确的基因.利用一种改进的体外转录方法获得包含CUEDC2基因靶序列的长链RNA,进而通过RNA酶H切割引导序列形成成熟siRNA.转染Hela细胞并进行免疫印迹检测.结果显示,运用此方法得到的siRNA能够有效地抑制细胞中内源CUEDC2的表达,此项方法为CUEDC2的深入功能分析奠定了基础.     

14-3-3η抑制TRIF和IKKε激活的IRF3的转录活性

为了研究EWS蛋白质对IRF3转录活性的影响,以及EWS蛋白对IRF3信号通路的调节,在真核细胞293T中表达Flag-EWS蛋白质,通过双荧光报告系统研究EWS对TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性的影响.结果显示Flag-EWS蛋白质能够在真核细胞293T中正确表达,过表达EWS,能够抑制TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性,而且能够直接抑制IRF3的转录活性.     

新型雌激素受体ERα36与窖蛋白-1在皮肤组织细胞中的表达和分布特征

采用蛋白免疫印迹杂交和免疫细胞荧光等方法首次研究了新型雌激素受体ERα36和窖蛋白-1（Caveolin-1）在大鼠皮肤组织中以及角质细胞系中的表达,探讨了二者的表达关系和分布特征.结果发现：（1）大鼠皮肤中有ERα36的表达,其表达的量与Caveolin-1的表达量呈负相关,且存在性别差异和部位差异;（2）表皮角质细胞中有ERα36的表达,主要分布在细胞膜上,且与Caveolin-1共定位.提示新型雌激素受体ERα36存在于皮肤细胞中,且可能参与Caveolin-1介导的雌激素信号转导,在雌激素治疗皮肤疾病过程中发挥一定作用.     

橙皮素对血管内皮细胞NO分泌功能的影响

考察了橙皮素对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NO分泌功能的影响,探讨其作用机制.为此采用DAN法测定HUVECs分泌NO的水平,用人乳腺癌MCF-7细胞(雌激素受体阳性)促增殖实验和报告基因模型实验评价橙皮素的雌激素样活性.结果显示在内源雌激素水平较低的条件下,橙皮素在12.5～100 μmoL/L浓度范围内,能够促进HUVECs分泌NO,并呈剂量依赖性.此作用能够被雌激素受体拮抗剂ICI182,780和放线菌素D阻断.橙皮素与E2同时作用时,HUVECs分泌NO水平较两者单独作用时显著下降.而在内源雌激素水平较高的条件下,橙皮素抑制HUVECs分泌NO.橙皮素能够促进MCF-7细胞增殖,并且能够被ICI182,780完全阻断,同时,橙皮素能够部分拮抗E2对MCF-7细胞的促增殖作用.另外,橙皮素能够诱导ERα控制的报告基因表达.从而可认为橙皮素属于雌激素受体部分激动剂,对血管内皮细胞NO分泌功能具有调节作用,其机理涉及雌激素受体信号途径和基因转录调节.     

雷洛昔芬通过调节端粒酶活性抑制Aβ所致神经细胞凋亡

目的:探讨雷洛昔芬是否具有类似于雌激素对转染了雌激素受体estrogen receptor(ER)α的PC12细胞有保护作用,即对抗淀粉样蛋白AB所致细胞凋亡及活化端粒酶活性.方法:在转染了雌激素受体ERα的PC12细胞(PCER)及转染了对照基因质粒的PC12细胞(PCCON)中分别添加不同的药物.用TUNEL染色法观察细胞凋亡情况;stretch PCR试剂盒分析端粒酶的活性.结果:在经过Aβ处理后的PCER中添加10-8 M雷洛昔芬与10-8雌激素后细胞凋亡数显著减少,而在PCCON中则无明显差异;雌激素和雷洛昔芬对PCER细胞显著促进其端粒酶活性,对PCCON 细胞无此作用.结论:雷洛昔芬与雌激素对有雌激素受体表达的PC12细胞均有活化端粒酶活性,抑制淀粉样蛋白Aβ诱发的细胞凋亡作用,表明雌激素和雷洛昔芬抑制Aβ所致细胞凋亡的作用是通过雌激素受体ER α来实现的.     

CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

EWS抑制TRIF和IKKε激活的IRF3的转录活性

为了研究EWS蛋白质对IRF3转录活性的影响,以及EWS蛋白对IRF3信号通路的调节,在真核细胞293T中表达Flag-EWS蛋白质,通过双荧光报告系统研究EWS对TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性的影响。结果显示Flag-EWS蛋白质能够在真核细胞293T中正确表达,过表达EWS能够抑制TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性,而且能够直接抑制IRF3的转录活性。     

P38α对人血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响

目的:研究P38α对人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的影响.方法:利用硝酸还原酶法检测不同浓度氯化钴作用下人脐静脉血管内皮细胞-12(HUVEC-12)上清中的一氧化氮(NO)的含量.以pRL-TK为内参照,将已经构建好的pGL2-eNOS-p质粒分别与pGL3-BASIC、pcDNA3、p38a、及p38a(AF)共转染HUVEC-12细胞,利用双荧光素酶报告基因技术检测eNOS基因启动子转录活性,并在共转染的基础上加氯化钴刺激,并检测eNOS基因启动子转录活性.结果:氯化钴刺激下HUVEC-12细胞培养上清的NO含量随氯化钴作用浓度增加而提高,成功建立化学缺氧模型;p38a在正常和缺氧条件下均明显降低eNOS基因启动子的活性,可被无活性诱变体p38a(AF)逆转.结论:P38et下调人血eNOS基因启动子转录活性.     

乳腺癌中CyclinB1表达及临床病理意义

目的:研究细胞周期蛋白B1、癌基因C-erbB-2和雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)在乳腺癌中的表达情况及临床意义.方法:采用S-P免疫组化方法对65例乳腺癌组织和15例乳腺纤维瘤组织进行cy-clinB1、C-erbB-2和ER、PR表达的联合检测.结果:乳腺癌组织中CyclinB1过阳性表达率为84.62%(55/65);乳腺纤维瘤组织CyclinB1表达率为13.3%(2/15);淋巴结转移患者CyclinB1蛋白的过阳性表达率明显高于淋巴结阴性患者;CyclinB1的表达与C-erbB-2表达具有相对的一致性,CyclinB1的阳性高表达伴随ER表达降低,但与PR的表达无显著相关性.结论:CyclinB1的过表达与乳腺癌的发生、发展相关,过表达cy-clinB1可为乳腺癌早期诊断和生物学行为的判断提供帮助.CyclinB1与C-erbB-2和ER、PR的联合检测有利于指导乳腺癌的化疗和判断预后.     

α-生育酚琥珀酸酯对乳腺癌细胞中IAPs家族蛋白表达的影响

目的检测α-生育酚琥珀酸酯(-αTOS)对MCF7和MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖以及细胞中凋亡抑制蛋白家族(IAPs)表达的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定-αTOS对人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-453增殖的抑制作用,细胞分别接种于96孔板后用浓度为51、0、255、0、75、1001、25和150μmol/L的-αTOS处理48 h后检测;细胞经50μmol/L、100μmol/L-αTOS处理122、4、48 h后,用RT-PCR的方法检测细胞内c-IAP1和c-IAP2 mRNA的转录水平;用Western Blot的方法检测c-IAP1和c-IAP2的蛋白质表达水平。结果-αTOS对人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-453有显著的增殖抑制作用,并表现为剂量依赖性,-αTOS对MCF7和MDA-MB-453的IC50值(细胞半数死亡的药物浓度)分别为132μmol/L和74μmol/L;RT-PCR结果显示,-αTOS使两个细胞系的c-IAP1的转录水平显著下降,且呈时间依赖性;但对c-IAP2的转录水平没有明显影响;Western Blot的结果发现-αTOS使得这两种细胞系的c-IAP1蛋白质翻译水平也呈下降趋势,该结果与mRNA转录水平下降相一致,对c-IAP2蛋白质的表达几乎无影响。因此,α-TOS可能通过抑制c-IAP1蛋白的表达而抑制MCF7和MDA-MB-453乳腺癌细胞的生长增值,a-TOS有望开发成为新的预防和治疗乳腺癌的有效药物。     

雌激素受体β与乳腺癌中关系的研究进展

目的探讨雌激素受体β(ERβ)与乳腺癌关系的研究进展.方法采用文献回顾分析方法,对ERβ的功能、分型,及其乳腺癌发生、发展、预后评估及内分泌治疗反应方面的可能作用加以综述.结果ERβ可能在乳腺癌发生中的作用、对预后及内分泌治疗反应方面具有重要作用.结论虽然ERβ研究结果不一致,但仍是一种新的乳腺癌预后评估指标.