CUEDC1抑制TNFalpha激活的AP-1的转录活性

为了研究CUEDC1蛋白质是否参与了AP—1信号通路,首先在真核细胞中成功表达了Flag—CUEDC1蛋白质,通过双荧光报告系统,研究了CUEDC1对AP—1信号通路的影响。结果显示,过表达CUEDC1能够显著抑制TNFα激活的AP—1转录活性,而对IFNα激活STAT3的转录活性没有影响,并且CUEDC1抑制AP—1转录活性影响是发生在TRAF2分子或者上游水平。     

CUEDC1氨基酸保守性分析及抑制TGF-beta /Smad转录活性

为了分析CUEDC1氨基酸保守性和研究CUEDC1蛋白质影响TGF-beta/SMAD信号通路的转录活性,用软件分析比较CUEDC1的氨基酸序列和通过双荧光报告系统测定TGF-beta/SMAD转录活性。结果显示cue结构域在人、小鼠和大鼠之间相似性为100%和过表达CUEDC1能够抑制TGF-beta/SMAD转录活性。     

CUEDC1的克隆表达及其对PRB和ERα转录活性的影响

为了研究CUE Domain Containing 1 (CUEDC1)蛋白质功能,构建了pcDNA3.0-Flag-CUEDC1表达载体,并且成功表达Flag-CUEDC1蛋白质.通过双荧光报告系统,对比CUEDC1与CUEDC2对PRB和ERα转录活性的影响.其结果显示,CUEDC2能够抑制PRB和ERα转录活性,而CUEDC1对PRB和ERα转录活性的影响不显著.     

磷酸酶PPM1G与IKKi相互作用下调IRF的转录活性

为了研究磷酸酶PPM1G对IRF信号通路的影响,首先在真核细胞中成功表达了HA-PPM1G蛋白质。应用双荧光报告系统,研究了PPM1G对IRF信号通路的影响。结果显示,过表达PPM1G能够显著抑制IKKi激活的IRF转录活性。进一步免疫共沉淀的实验结果表明,PPM1G和IKKi在细胞内存在相互作用。     

14-3-3η抑制TRIF和IKKε激活的IRF3的转录活性

为了研究EWS蛋白质对IRF3转录活性的影响,以及EWS蛋白对IRF3信号通路的调节,在真核细胞293T中表达Flag-EWS蛋白质,通过双荧光报告系统研究EWS对TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性的影响.结果显示Flag-EWS蛋白质能够在真核细胞293T中正确表达,过表达EWS,能够抑制TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性,而且能够直接抑制IRF3的转录活性.     

EWS抑制TRIF和IKKε激活的IRF3的转录活性

为了研究EWS蛋白质对IRF3转录活性的影响,以及EWS蛋白对IRF3信号通路的调节,在真核细胞293T中表达Flag-EWS蛋白质,通过双荧光报告系统研究EWS对TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性的影响。结果显示Flag-EWS蛋白质能够在真核细胞293T中正确表达,过表达EWS能够抑制TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性,而且能够直接抑制IRF3的转录活性。     

Tet-off诱导表达CUEDC2稳定细胞系的建立

CUEDC2(CUE domain containging protein 2)是近年来发现的一个功能尚未十分明确的蛋白质。实验室前期的研究表明,CUEDC2通过影响孕激素受体PR抑制乳腺癌细胞生长。此外,研究还发现CUEDC2通过招募PP1磷酸酶,促进IKK复合体的去磷酸化,抑制NF-kB信号通路的激活。为了深入研究CUEDC2的功能,构建了CUED2可诱导表达载体(p617-neo-T-CUEDC2-I-tTA4),并通过逆转录病毒系统获得tet-off可诱导表达CUEDC2的稳定细胞系。该诱导表达细胞株的建立为CUEDC2功能基因的研究提供了必要的手段。     

AWP1抑制TNFα诱导的NF-κB转录活性

AWP1含有A20样锌指蛋白结构域。在人乳腺文库中克隆了AWP1 cDNA序列。双荧光报告基因检测系统证明过表达AWP1抑制TNFα诱导的NF-κB转录激活,并且AWP1与TNFα受体复合物中的TRAF2、IKKγ存在外源相互作用,为AWP1抑制TNFα信号通路的机制研究提供线索。     

ICAM-1在NF-κB通路中表达的研究进展

细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),属于免疫球蛋白超家族中的一员,其主要功能是参与白细胞的迁移,来作为T淋巴细胞活化信号和调节炎性因子的表达.因此,ICAM-1表达量的变化与机体多种疾病相关.ICAM-1启动子区域含有大量能与转录因子及协同刺激物结合的基因位点,因而多种信号通路及转录因子参与调节ICAM-1的转录表达.NF-κB通路作为重要的炎症信号通路,同样也是调控ICAM-1表达的一条关键性转录通路.在炎症、病毒及肿瘤等疾病条件下,多种细胞因子能够通过激活NF-κB通路,从而改变ICAM-1的基因及蛋白表达水平.同时,ICAM-1作为疾病治疗中重要的靶点,为疾病的治疗开辟了新的道路.     

HeLa细胞中激酶NUAK1调控Tuberiun的磷酸化

NUAK1是LKB1的下游激酶之一,可被LKB1磷酸化而激活,但对其在LKB1相关信号通路中的功能仍缺乏了解.本研究发现在HeLa细胞中重建LKB1表达后NUAK1与tuberin蛋白免疫共沉淀,提示在野生型LKB1存在时NUAK1与tuberin可能存在直接相互作用.进一步的激酶活性测定和in vivo蛋白磷酸化实验表明:在HeLa细胞中葡萄糖匾乏条件下,野生型LKB1可显著激活NUAK1的激酶活性;而被激活的NUAK1可明显提高tuberin 的磷酸化水平,使用NUAK1 siRNA pool干扰NUAK1的表达则几乎将tuberin的磷酸化水平降低为零.上述结果表明NUAK1可能介导了LKB1对tuberin磷酸化的调节,进而下调mTOR通路,抑制蛋白质合成与细胞生长增殖.     

IRS1在藻蓝蛋白介导的H460细胞增殖和迁移调控中的作用

藻蓝蛋白来源于海洋藻类,是我国认可的食品着色剂和功能型食品．初期研究表明,藻蓝蛋白处理能抑制人类非小细胞肺癌系H460的体外增殖能力和迁移能力,使得其体外集落形成能力减弱．通过转录组学测序分析进一步探究具体作用机制,从藻蓝蛋白处理前后发生显著变化的基因中,筛选出了一个藻蓝蛋白处理后发生显著下调的基因,即胰岛素受体底物1（irs1）,并通过体外转染siRNA的方法抑制IRS1的表达,来研究其对非小细胞肺癌系H460的增殖和迁移能力的影响．采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移,克隆形成实验检测细胞集落形成能力,流式细胞术检测细胞周期分布．结果表明,下调IRS1的表达后,与对照组相比,细胞的生长速率降低,迁移能力、集落形成能力受到抑制,同时使细胞周期被阻滞到G1期．PI3K-AKT信号通路研究表明,藻蓝蛋白处理使得PI3K-AKT信号通路活性受到抑制,下调IRS1的表达使得PI3K-AKT信号通路部分蛋白表达也下调,通路活性受到一定程度抑制．本研究结果表明,藻蓝蛋白抑制非小细胞肺癌系H460体外活性功能的机制,可能与IRS1的表达和PI3K-AKT信号通路的活性有关,这为藻蓝蛋白的调控机制提供了有力的理论基础．      

多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的调节作用

研究多泛素链延伸酶E4B对TLR信号通路的影响.在HEK293T细胞中,通过双荧光报告系统检测E4B对TLR信号通路的影响,并且用免疫共沉淀的方法鉴定E4B的相互作用蛋白质.发现多泛素链延伸酶E4B能够抑制TLR通路的下游转录因子NF-κB和IRFs的转录活性,并且能与TRAF6发生相互作用.提示多泛素链延伸酶E4B可能参与TLR信号通路的调控,为TLR信号通路的研究提供新的线索.     

致病性不同的两种流感病毒NS1蛋白对人源细胞IFN-β转录抑制的比较

A型流感病毒编码的NS1蛋白是病毒关键的致病因子,可以通过多种机制拮抗宿主抗病毒反应.病毒感染过程中,NS1通过抑制NF-κB和IRF3两种转录因子的活性,下调IFN-β转录水平以阻断其诱导的信号通路.实验选取病毒母本致病性不同的两种NS1蛋白(NS1-a,NS1-h),通过RT-PCR、报告基因和VSV病毒滴度等实验证明高致病性禽流感病毒NS1-a与普通人流感病毒NS1-h相比,表现出较强的抑制IFN-β转录能力,并有效帮助VSV病毒复制.此差异源于NS1-a更加有效抑制NF-κB活性以及IRF3激活后的入核行为,与IFN诱导的ISG转录无关.所得结果为阐释流感病毒致病性与NS1的密切关系提供线索.     

胃癌芯片数据中异常转录因子推断与信号通路分析

用一种新的转录因子介导的信号通路分析方法分析肿瘤芯片数据,从中推断异常的转录因子和信号通路.先通过统计目标基因的表达推断转录因子的活性,然后将那些活性异常的转录因子映射到KEGG信号通路上.此方法整合了基因表达调控的实验数据和信号通路信息.利用此方法,对斯坦福芯片数据库中的162个人类胃癌数据进行分析,结果发现,大部分芯片中的TGF-beta,JAK-STAT,NF-kappaB和Notch信号通路被异常激活.进一步对这些通路进行研究,将有助于探究胃癌的发生、发展机理和进行合理的药物设计.     

Rac1突变重组体的构建及对JAK/STAT信号通路的影响

通过构建Rac1突变体，研究Rac1激活对肾小球系膜细胞(MES)JAK2/STAT3信号通路的影响.以Rac1目的基因为模板，在引物中设计突变，扩增突变体Rac1(G12V)的目的基因，与PiggyBac(PB-FLAG)载体质粒连接，构建突变重组体PB-Rac1(G12V),并运用脂质体核酸试剂转染系膜细胞.比较正常组、Rac1(G12V)突变组中系膜细胞的ROS含量及NADPH氧化酶活性；Elisa法检测细胞因子TGF-β表达水平；Western blot法检测系膜细胞中JAK2/STAT3信号及FN蛋白的表达.结果表明，成功构建了Rac1(G12V)持续磷酸化突变体并在MES细胞中表达，与正常组相比，Rac1(G12V)激活突变MES细胞NADPH氧化酶的活性和ROS含量明显增加；JAK2/STAT3信号通路激活，TGF-β和FN表达明显增加.Rac1能激活系膜细胞氧化应激和JAK2/STAT3信号通路，并促进TGF-β及FN的表达.     

转录因子Bach1在心血管疾病中的研究进展

转录因子Bach1(BTB-CNC同源体1, BTB and CNC homology 1)是一种转录抑制因子, 广泛存在于哺乳动物的各种组织中. Bach1能抑制血红素环氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)等抗氧化基因的表达, 参与氧化应激反应. Bach1基因敲除对心肌缺血再灌注损伤有保护作用. 近期研究发现Bach1能抑制Wnt/b-catenin信号通路和小鼠缺血下肢血管新生. 主要就Bach1在心血管疾病中的研究进展进行简要综述.     

MdmX在Axin-p53信号通路中的调控机制

鼠双微体基因X(MdmX)是肿瘤抑制因子p53信号通路中重要的负调控蛋白,它能与p53直接结合,抑制p53的转录活性.体轴发育抑制因子Axin作为构架蛋白与p53及同源结构域互作蛋白激酶2(HIPK2)等相互作用形成复合物,诱导p53的转录活化,共同促进细胞的凋亡.本研究将MdmX引入Axin-p53信号通路的调控中,发现MdmX通过竞争Axin与p53的结合,抑制Axin诱导p53的转录激活.p53结合区域缺失的MdmX突变体MdmXΔp53则不能抑制Axin对p53的激活.这些实验结果为进一步深入研究Axin-p53信号通路在细胞凋亡及肿瘤发生发展中的作用提供了重要的理论依据.     

人类TBC1D7蛋白的表达纯化及其在mTOR通路中的作用机制研究

mTOR信号通路在真核细胞代谢调控中发挥着关键的调控作用，该通路核心元件mTORC1复合物的活性受其上游TSC复合物负调控，TSC复合物包括TSC1、TSC2、TBC1D7三种蛋白.以TBC1D7蛋白为研究对象，通过氨基酸序列比对显示多物种来源的TBC1D7蛋白具有较高的保守性，且蛋白三维结构分析证实其分子表面存在高度保守区域.随后，构建了人类TBC1D7蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达得到全长TBC1D7蛋白，经过酶切去除标签和凝胶排阻层析得到了高纯度TBC1D7蛋白.另一方面，通过在HCM细胞中对TBC1D7进行敲降和过表达，证实了TBC1D7的表达会直接升高mTORC1的活性；反之，升高TBC1D7的表达则会抑制mTORC1的活性.本研究表达和纯化了人类TBC1D7蛋白，并探讨了在人类心肌细胞中TBC1D7的表达与其下游mTOR信号通路之间的联系，为人类TBC1D7蛋白和mTOR信号通路的进一步研究打下了良好基础.     

nPKC-PKD3信号传导途径介导Prostratin活化HIV-1转录

采用HIV-LTR-Luc稳定细胞株分析其荧光素酶活性,研究Prostratin活化潜伏的艾滋病毒的分子机制.实验结果表明:随药物浓度升高和处理时间延长,Prostratin能明显激活HIV-1转录.采用PKC抑制剂拮抗nPKC活性,能有效阻断Prostratin对HIV-1的激活;反之,过表达nPKC能激活HIV-1转录.最后,敲低PKD3高效拮抗Prostratin激活的HIV-1转录.因此,nPKC-PKD3信号途径参与Prostratin活化HIV-1转录,从而激活潜伏的艾滋病毒.本研究为开发新的抗艾滋病药物筛选模型提供了可靠的理论依据.     

逆转录病毒感染结合流式细胞分选方法构建稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系

CUEDC2（CUE domain containing protein 2）是本实验室发现的功能未知蛋白质。已有研究证明CUEDC2通过抑制孕激素受体PR影响乳腺癌细胞的生长,同时CUEDC2的高表达能够降解雌激素受体ER而导致乳腺癌内分泌治疗耐药。为了深入研究CUEDC2在乳腺癌中的功能,我们构建了稳定过表达CUEDC2的MCF-10A细胞系。利用逆转录病毒将非融合形式的绿色荧光蛋白质GFP和CUEDC2基因稳定整合至靶细胞的基因组中,经过流式分选获得GFP阳性细胞,即为稳定表达CUEDC2的细胞株。上述方法高效快捷,极大提高了稳定细胞株的构建效率。同时该稳定细胞株的建立为CUEDC2的功能研究提供了必要的工具。