多能硫杆菌RubisCO基因的亚克隆及各种启动子对其表达的影响

将多能硫杆菌ＲｕｂｉｓＣＯ基因从两个方向亚克隆到ｐＢＲ３２２和ｐＫＫ２２３－３载体上，通过酶切的方法对各种质粒的插入方向进行了确证。并进一步对这两种插入方向的质粒在大肠杆菌中的表达情况进行了酶活性的测定，该基因片段在ｐＫＫ２２３－３载体的ｔａｃ启动子的启动下，表达活性比ｌａｃ妄动子以及ｐＢＲ３２２载体上的Ｐ１和Ｐ２启动子高。     

环状芽孢杆菌中具有强启动活性DNA片段的结构与功能分析

作者曾用启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽孢杆菌Ｃ－２菌株（ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＣ－２）中克隆到一个具有强启动功能的２．４ｋｂ片段ＢＣ６．对该片段作作的进一步缺夫分析表明,其３’端约０．７ｋｂ片段具有单独的基因启动子功能,序列分析表明ＢＣ６片段３′端有典型的原核生物的基因启动子结构,现有ＢＣ６的５’端的１．２ｋｂＸｈｉＩ片段的重组于ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲＩ位点,观察其对两侧具有不同     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

具全期启动子盒的杆状病毒高效表达载体的组建与应用

通过ＰＣＲ扩增，得到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）具早晚期启动子元件的ｐ３５基因启动子，将其插入到杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３多克隆位点上游，使之与ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３质粒中的人工合成后期启动子（ＰＳｙｎ）、多角体ＸＩＶ启动子（ＰＸＩＶ）串联构成早期、晚期、极晚期能持续启动外源基因表达的转移载体质粒ｐＳＸ３５．将ｐＳＸ３５用于组建含ＨＢｓＡｇ基因并形成多角体的重组ＴｎＮＰＶ，ＨＢ－ｓＡｇ基因的表达量显著提高，表达时间亦明显提前，从而实现了外源基因在杆状病毒表达系统的全期、高效表达．ｍＲＮＡ引物延伸试验结果显示，Ｐｐ３５在重组病毒中可产生２套转录本，分别于病毒感染的早期和晚期起始ＨＢｓＡｇ基因的表达．     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

环状芽胞杆菌（Bacillus circulans）基因表达效率调节DNA片段的研究

用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ１从环状芽胞杆菌（Ｅａｃｉｌｌｕａｅｉｒｃｕｌａｎｓｃ－２）基因组中分离的启动子片段ＢＣ６能使无启动子的卡那霉素抗性基因恢复活性，并在大肠杆菌中获得高效表达（卡那霉素抗性高达１２００μｇ／ｍＬ）．当用限制酶ＸｂａⅠ去除其５′－端１．２ｋｂ片段（命名为Ｘｂ片段）后，３′－端片段仍能启动Ｋａｎ￣ｒ基因表达，其抗性水平降至４００μｇ／ｍＬ但当１．２ｋｂ片段反向插回原有位置时，其抗性水平降至６００μｇ／ｍＬ．将Ｘｂ片段正向插入另一重组质粒ｐＢＣ３中融合的Ｋａｎ￣ｒ基因启动子的上游时，卡那霉素抗性由２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ．当Ｘｂ片段反向插入时，Ｋａｎ￣ｒ基因的表达却明显受到抑制，降为１００μｇ／ｍＬ．这说明Ｘｂ片段具有正向增强而反向衰减Ｋａｎ￣ｒ基因表达的能力．用ＢＣ６片段的两个亚克隆片段与ｃ－２菌株总ＤＮＡ分别作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交时，结果显示３′－端片段以单拷贝形式存在于基因组中，而Ｘｂ片段则以多拷贝形式散布其中．由此推断Ｘｂ片段并非一定伴随该基因启动子存在．     

大肠杆菌基因启动子探针型载体的构建

利用ＰＣＲ技术将ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中的多克隆位点区（ＭＣＳ）及旁侧序列分别进行扩增,然后将扩增产物插入到已除去ＬａｃＺα基因的ｐＵＣ１８中,获得三个中间载体ｐＳＵＧＶ１,ｐＳＧＶ２和ｐＳＵＧＶ３,最后将ｐＳＵＰＶ２中无表达活性的新霉素磷酸转移酶Ⅰ（ＮＰＴⅠ）基因分别插入到三个中间载体的ＭＣＳ中,构建成功大肠肝菌基因启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ４,ｐＳＵＰＶ５和ｐＳＵＰＶ６．     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合     

恶臭假单胞菌萘质粒ⅠNL基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧ７）携带的质粒ＮＡＨ７，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４，６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ｐＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ｐＫＡＯ质粒，此质粒经ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚屯隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱。从ｐＮＮＩ质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎａｈＬ的ｋｐｎＩ－ｋｐｎＩ片段（２．３ｋｂ）．正向插入载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＋中获得重组质粒ｐＮＮ２，反向插入为ｐＮＮ３，将其转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中，目的基因得以大量增殖。     

红假单胞菌R18二氧化碳固定基因的序列测定及其表达

在红假单胞菌Ｒ１８质粒的限制性酶切基础上,建立了该质粒的物理图谱;采用ｄｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法测定了Ｒ１８ ＲｕｂｉｓＣＯ基因的部分核酸序列;以ＰＢＲ３２２为载体,将Ｒ１８ ＲｕｂｉｓＣＯ基因转入紫色非硫杆菌Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ Ｎｏ．７的野生菌及其ＲｕｂｉｓＣＯ ＦｏｒｍＩ缺陷型中,获得的转化子ＭＧ１１和ＭＧ１４的ＲｕｂｉｓＣＯ酶活性分别是其受体菌的１．７７倍和７．１     

Subcloning and Sequencing of the Form II Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase from Rhodopseudomonas palustris

0　IntroductionRibulose 1,5 bisphosphate (RuBP)carboxylase/oxygenase(RubisCO)isoneofkeyenzymesofthere ductive pentose phosphate pathway ,orCalvin Bassham Bensoncycle .RubisCOisabifunctionalen zymethatcatalyzesthefirststepinthecarbondioxideassimilatorypathwayandphotorespiratorypathwayinallphotosyntheticorganisms ,includingplants ,algae ,cyanobacteria ,andmostphotosyntheticbacteria[16 ] .Thus ,itispositionedtoregulatetheflowofcellcar bonthroughtwocompetingmetabolicpathways .Itisreportedtha…     

烟草MnSoD cDNA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

烟草锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一种由核基因编码并定位于线粒体的蛋白质,是植物体内清除超氧根阴离子的主要酶类．采用RT—PCR方法,从烟草(Nicotiana tubaccum)中克隆到MnSODeDNA基因(SodA),序列分析结果与文献报告的资料相比,核苷酸序列的同源性为99．9％,氨基酸序列的同源性为99．6％．该基因能在原核表达载体pBV221中正确表达,并表现出SOD酶活性．     

偶氮染料脱色优势菌的特性及基因定位初步研究

对分离到的两株偶氮染料脱色优势菌的特性和控制脱色的基因定位进行了研究,结果表明,两株脱色优势菌均为兼性厌氧菌,生长受ｐＨ值影响较大,适应温度范围较广;它们均能有效脱除偶氮染料的色度;它们都含有质粒,其携有控制偶氮还原酶产生的基因;通过质粒转化得到的转化子较之其野生菌有更好的脱色效果．     

hSOD基因在大白鼠肺上皮细胞中的表达

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ为运载体,构建了受控于ＣＭＶ启动子的ｈＳＯＤ基因的表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ＿ＳＯＤ,用脂质体转染法转染大白鼠肺上皮细胞Ｌ２细胞后,经抗生素Ｇ４１８选择性培养,获得与细胞染色体ＤＮＡ稳定整合的ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞,经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｓ分析,结果表明,ｈＳＯＤ在细胞中得到稳定表达,同时测定细胞ＳＯＤ酶活性,ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞的ＳＯＤ酶活性是空载体导入细胞和父本细胞的约２倍,并且在选择细胞克隆之后的６０天内是持续的．     

4种兜兰RubisCO的分离纯化及酶学性质初步研究

采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析与凝胶过滤层析的方法，分离纯化得到硬叶（P. micranthum）、紫纹（P. purpurattum）、带叶（P. hirsutissimum）和亨利（P. henryanum）4种兜兰RuBisCO的大、小亚基，分子量分别为51.5~54.5kD和15~16kD. 4种兜兰RubisCO的羧化/加氧活性在pH8.0、温度30℃时最高，其活性大小顺序为硬叶兜兰紫纹兜兰亨利兜兰带叶兜兰，且紫纹兜兰、亨利兜兰的羧化/加氧活性比值相对高于硬叶兜兰、带叶兜兰；硬叶兜兰RubisCO的Km（RuBP）值最小.4种兜兰RubisCO的特性反映了其不同的生理和生境特征.     

PheAB基因在棒状杆菌染色体上的整合

改造大肠杆菌质粒ｐＬＣＸ３１,切除其中的ｘｙｌＥ基因得到大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１．将源于大肠杆菌分枝酸变位酶－预苯酸脱水酶基因２．３ｋｂ ＢａｍＨＩ片段克隆到大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１中启动子Ｐ３２的下降,构建成质粒ｐＪＬ０２。再在ｐＪＬ０２的ＨｉｎｄⅢ位点接入棒状杆菌染色体的ＨｉｎｄⅢ消化的随机片段,构建成带不同棒状杆菌染色体片段而不带棒状杆菌自主复制顺序的棒状杆菌整合质粒ｐＪＬ０３。     

Reconstruction of enzymatic activity from split genes encoding glyphosate-tolerant EPSPS protein of Psedomonas fluorescens G2 strain by intein mediated protein complementation

N-phosphonomethylglycine, commonly referred to as glyphosate, is a broad-spectrum, non-selective herbicide used for the control of weeds in glyphosate-to- lerant crops. Glyphosate inhibits the 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), a key en…     

降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活性对外源癌基因诱导的NIH3T3转化的逆转作用研究

用ＰＡＲＰ酶抑制剂苯甲酰胺（ＢＡ）处理经ｃ－Ｈａ－Ｔ２４－ｒａｓ活化癌基因转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞得到转化细胞系，结果表明：经苯甲酸胺处理的细胞系，其细胞凝集、血清依赖性、形态特征等均发生了改变，呈现出正常细胞的特征．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，已整合到细胞基因组中的外源Ｔ２４～ｒａｓ基因发生了丢失．