前交叉韧带组织工程种子细胞筛选的初步研究

为组织工程方法构建前交叉韧带筛选一种理想的种子细胞。用体外分离培养兔前交叉韧带（ACL）、内侧副韧带（MCL）、跟腱（AT）、皮肤成纤维细胞（SK）,比较四种细胞的生长状态、增殖活性及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌量。在含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液中,四种细胞生长良好、细胞形态相似,但以SK细胞生长最快,AT细胞次之,MCL细胞和ACL细胞生长最慢。SK、MCL、ACL细胞均分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原,AT细胞只分泌Ⅰ型胶原。SK细胞Ⅰ型胶原染色密度较MCL、ACL、AT细胞高,SK细胞Ⅲ型胶原染色密度较MCL、ACL细胞高。说明SK细胞增殖活性高,分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原多,取材简便,是理想的前交叉韧带组织工程种子细胞。     

DiI荧光标记的软骨细胞与支架材料复合后的观察

目的:通过Dil荧光染料标记观察软骨细胞在聚乳酸/乙醇酸共聚物支架(PLGA)体外和体内培养环境中的生长状态,为研究组织工程化软骨探索一种理想的软骨细胞示踪方法.方法:体外分离培养大鼠剑突软骨细胞,应用DiI标记软骨细胞,通过MTT法测定细胞的增殖活性.DiI荧光标记的软骨细胞种植于PLGA支架上分两组:一组体外培养1周,另一组体外培养1周后,再植入同系大鼠大网膜体内培养1周.分别取出细胞一支架复合物,在荧光显微镜下观察体外和体内条件下软骨细胞的荧光表达情况.结果:应用DiI标记不影响软骨细胞的增殖,MTT测定结果显示标记组和对照组的A值未见显著性差异(P>0.05).标记后的软骨细胞显示环状红色荧光,胞核未着色.体外培养和体内培养的软骨细胞一支架复合物,均可在荧光显微镜下观察到红色荧光表达.结论:DiI荧光染料能够有效标记软骨细胞,标记的细胞一支架复合物可直接在荧光显微镜下进行观察,可作为体外和体内构建组织工程软骨的较好的示踪方法.     

以组织工程技术构建活性双层人工皮肤

用冷冻干燥胶原凝胶方法制备胶原海绵,经戊二醛交联处理,作为活性双层人工皮肤的支架;以幼儿包皮为细胞来源获得真皮成纤维细胞和皮肤角质细胞,体外扩增后作为种子细胞;在胶原海绵上接种成纤维细胞和角质细胞,体外构建活性双层人工皮肤。研究结果表明,人工真皮内的成纤维细胞生长良好,并且有人纤粘连蛋白类生物活性物质存在,活性双层人工皮肤表皮层有类似干天然皮肤表皮层的组织结构。     

CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞可行性分析

采用荧光染料CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞(SPC),评价其生物可行性.分离和培养SPC,采用CMDiI进行标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记效果和传代后的细胞标记率.同时,进行细胞爬片培养后免疫荧光染色,观察标记后细胞表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)的情况.进行台盼蓝排斥实验、细胞粘附实验、细胞增殖实验和细胞迁移实验,观察标记后的SPC存活率以及粘附、增殖和迁移能力的变化.结果发现,培养4d左右可见SPC开始生长,一周后出现SPC克隆.通过免疫荧光和流式细胞术分析,CM-DiI标记率为96%左右,连续传代2周后标记率仍在40%以上.标记后的细胞可表达α-SMA、Calponin和PCNA.同时发现,标记后的细胞存活率无明显降低,细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变.本研究证明采用CM-DiI标记SPC操作简便,效果好,不改变细胞表型,不影响细胞的存活率和粘附、增殖及迁移能力,可作为SPC的荧光示踪剂.     

新型前交叉韧带支架材料的构建及其生物相容性的实验研究

探讨以聚羟基丁酸己酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1∶1)胶原杂化支架作为前交叉韧带组织工程载体材料的可行性。制备"三明治"样结构PHB/PLLA共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA胶原杂化支架,共培养5d后,扫描电镜下观察其在材料上生长情况。PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的皮肤成纤维细胞成功种植在支架材料上,在材料上粘附、生长良好。说明构建的支架材料具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

自体细胞来源的组织工程皮肤及其实验研究

利用患者自体来源的皮肤细胞,在经过短时间的体外培养后构建组织工程皮肤,并对其移植后的转归进行动物实验观察.分离培养头皮中的角质形成细胞及创面来源的成纤维细胞,并在体外进行传代扩增.利用三维立体培养系统构建复合细胞膜片,移植于裸鼠背部全层缺损创面,以单层细胞膜片为对照,对其转归进行大体及病理学观察.体外分离培养的皮肤细胞在体外扩增2周后即可用于构建复合细胞膜片,在移植覆盖裸鼠全层皮肤创面后,伤口愈合良好,移植2月后的病理结果显示皮肤结构明显优于单层膜片移植.证明利用患者自体来源的皮肤细胞可快速构建组织工程皮肤,有望成为治疗大面积深度烧伤患者的途径之一.     

大鼠原代肝细胞的标记和移植方法

探讨CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度、细胞的移植量和移植途径.采用原位胶原酶灌注和密度梯度离心法分离、纯化大鼠肝细胞,用不同浓度CM-DiI进行标记,筛选出CM-DiI的最佳标记浓度,分别从门静脉、尾静脉移植到2/3肝切除0h大鼠,对细胞移植36h后的肝组织石蜡切片和冰冻切片分别进行免疫组织化学分析和荧光观察.结果显示,4μmol·mL-1浓度的CM-DiI和肝细胞孵育5min,细胞标记率高达95%.每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)和0.2,0.4,0.6mL移植后检测到的标记细胞数目相比有显著性差异(P0.01),经肝门静脉移植后可以检测到的标记细胞数比尾静脉多(P0.01).CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度为4μmol·mL-1,标记细胞的最佳移植量为每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)、最佳移植途径为经肝门静脉移植.     

毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选

构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1 cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+ 10％ FBS、37℃5％CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.     

电气石/水凝胶复合材料体外细胞相容性评价

为检测电气石的体外细胞相容性,将电气石粉按不同的比例复合到水凝胶中并与人成骨肉瘤MG63细胞共培养,采用光镜、荧光染色、MTT法评价电气石的体外细胞相容性.实验结果表明,人成骨肉瘤MG63细胞与不同含量电气石/水凝胶复合材料共培养均能够正常生长增殖且形态良好,电气石所具有的良好体外细胞相容性可用作组织修复材料.     

N/C对碳氮膜修饰的多壁碳纳米管细胞相容性的影响

为改善碳纳米管的细胞相容性,通过离子束辅助沉积方法在由化学气相沉淀法制备的多壁碳纳米管表面沉积纳米厚度的碳氮膜以进行表面修饰.通过观察L929小鼠肺部成纤维细胞、EAHY926人内皮细胞和兔血红细胞在修饰前后的碳纳米管表面的黏附和生长状态可知,沉积CNx膜的多壁碳纳米管的细胞相容性优于沉积前,表现出良好的生命活性和增殖状态,同时,较高的N/C比有利于细胞在沉积CNx膜碳纳米管表面的增殖和生长以及细胞形态的伸展.     

Green Electrospun Silk Fibroin/Galactose Chitosan Composite Nanofibrous Scaffolds for Hepatic Tissue Engineering

The electrospun nanofibrous scaffolds made of proteins and polysaccharides were thought to be able to simulate the structure of natural extracellular matrix well.Silk fibroin(SF)and chitosan(CS)are probably the most widely used natural materials in biomedical fields including liver tissue engineering for their good properties and wide variety of sources.The asialoglycoprotein receptors of hepatocyte were reported to specifically recognize and interact with galactose.In this work,a green electrospun SF/galactosylated chitosan(GC)composite nanofibrous scaffold was fabricated and characterized.The data indicated that the addition of GC greatly influenced the spinning effect of SF aqueous solution,and the average diameter of the composite nanofibers was about 520nm.Moreover,the green electrospun SF/GC nanofibrous scaffolds were demonstrated significantly enhancing the adhesion and proliferation of hepatocyte(RH35)according to our data.The present study did a useful exploration on constructing scaffolds for liver regeneration by green electrospinning,and also laid a good foundation for the further applicative research of this green electrospun scaffolds in liver tissue engineering.     

微重力细胞培养与组织工程

组织工程主要致力于组织和器官的形成和再生，其核心就是建立细胞与生物材料的三维复合体，形成具有生命力的活体组织，用于对病损组织进行形态结构和功能的重建并达到永久性替代。目前有关微重力和模拟微重力条件下细胞体外生长的研究提示微重力培养环境有利于细胞体外增生，维持有功能的细胞长期生长，并且有助于形成组织样结构，使培养得到的组织更接近于活体组织。因此微重力细胞培养为组织工程的研究开辟了新的前景。     

纳米相陶瓷支架与人成骨细胞生物相容性的体外实验研究

研究了2种新型多孔纳米陶瓷支架材料(hydroxyapatite,HA和tricalcium phosphate,TCP)的生物相容性.从人4月龄胚胎骨膜组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞(periosteal-derived osteoblast,POB),采用人胚骨膜成骨细胞与2种陶瓷支架的体外复合培养,观察细胞在材料上的生长及生理功能表达情况.发现人POB在HA和TCP表面生长繁殖良好,并发挥成骨功能.材料对细胞的增殖还有一定的促进作用(p<0.05).实验表明: 2种新型多孔陶瓷支架材料均有良好的生物相容性.     

Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells promoted by overexpression of connective tissue growth factor

Objective: Large segmental bone defect repair remains a clinical and scientific challenge with increasing interest focusing on combining gene transfection with tissue engineering techniques. The aim of this study is to investigate the effect of connective tissue growth factor (CTGF) on the proliferation and osteogenic differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: A CTGF-expressing plasmid (pCTGF) was constructed and transfected into MSCs. Then expressions of bone morphogenesis-related genes, proliferation rate, alkaline phosphatase activity, and mineralization were examined to evaluate the osteogenic potential of the CTGF gene-modified MSCs. Results: Overexpression of CTGF was confirmed in pCTGF-MSCs. pCTGF transfection significantly enhanced the proliferation rates of pCTGF-MSCs (P<0.05). CTGF induced a 7.5-fold increase in cell migration over control (P<0.05). pCTGF transfection enhanced the expression of bone matrix proteins, such as bone sialoprotein, osteocalcin, and collagen type I in MSCs. The levels of alkaline phosphatase (ALP) activities of pCTGF-MSCs at the 1st and 2nd weeks were 4.0- and 3.0-fold higher than those of MSCs cultured in OS-medium, significantly higher than those of mock-MSCs and normal control MSCs (P<0.05). Overexpression of CTGF in MSCs enhanced the capability to form mineralized nodules. Conclusion: Overexpression of CTGF could improve the osteogenic differentiation ability of MSCs, and the CTGF gene-modified MSCs are potential as novel cell resources of bone tissue engineering.     

BHK-21细胞在生物材料溶液中黏附及增殖比较

目的比较BHK-21细胞在3种生物材料溶液中黏附及增殖情况,探讨以类人胶原蛋白为基础制备组织工程材料的可行性。方法将BHK-21细胞分别种植于类人胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸以及共混溶液中,在倒置显微镜下观察细胞的黏附和生长情况,并利用MTT方法检测种植后1～5 d细胞的增殖情况。结果BHK-21细胞种植12 h,类人胶原蛋白、壳聚糖以及两者共混溶液能显著促进BHK的黏附(P<0.01);BHK-21细胞在类人胶原蛋白溶液及类人胶原蛋白与其他生物材料共混溶液中功能活跃,维持其形态且能持续增殖,其中类人胶原蛋白/壳聚糖共混溶液促细胞增殖能力最强。结论类人胶原蛋白能够维持BHK细胞的生长与繁殖,在组织工程领域是一种极有潜力的组织工程材料。     

Biocompatibility studies of silk fibroin-based artificial nerve grafts in vitro and in vivo

Silk fibroin(SF)has been used extensively in the biomedical field including tissue engineering for the generation of artificial bones,skins or ligaments.We have previously reported on good in vitro biocompatibility of SF fibers with peripheral nerve tissues and cells.In the present study,we developed a novel design of the SF-based artificial nerve graft(SF graft)which was composed of a SF-nerve guidance conduit(NGC)inserted with SF fibers.MTT assay was performed to determine the cytotoxicity of the SF-NGC extract fluid on the cultured L929 cells derived from an immortalized mouse fibroblast cell line.In addition,this SF graft was implanted into adult rats for bridging a 10-mm long sciatic nerve defect.The following-up experiments at initial stage(1-4 week)of nerve regeneration including routine blood tests and histochemical investigation were conducted to evaluate the in vivo biocompatibility of the SF graft with peripheral nerves.The results demonstrated that the SF-NGC graft was biocompatible with the surrounding tissues and cells due to its low inflammatory potential with a grade 0 under the U.S.Pharmacopeia guidelines and it was generally suitable to a certain degree for bridging peripheral nerve defects in virtue of supporting Schwann cell adherence,expansion and migration.Therefore the SF graft is a promising alternative to classical autografts for peripheral nerve repair.     

用^211At和^131I标记蛋白质的研究

报道了砹—211和碘—131标记蛋白质的方法.通过过氧化氢或氯胺T直接氧化制备,使用凝胶色谱从反应产物中分离标记蛋白质,相对法比较放射性计数测定标记产率,过氧化氢适用于~(211)At标记蛋白质,氯胺T有利于~(131)I标记蛋白质.8次实验的结果表明,用过氧化氢氧化标记的~(211)At牛血清白蛋白产率96.4％,氯胺T氧化标记的~(?)I牛血清白蛋白产率66.1％.间接法标记蛋白质,放射性核素~(211)At同对氨基苯甲酸反应获得对—~(211)At—苯甲酸,经乙醚萃取和高效液体色谱分离,然后再偶联到免疫球蛋白或牛血清白蛋白上。动物实验结果表明,此种结合的标记蛋白质在体内稳定,标记率不低于初始~(211)At放射性活度的40%.     

重组人碱性成纤维细胞生长因子诱导Balb/c3T3细胞增殖的实验研究

目的研究不同浓度重组人碱性成纤维细胞因子对Balb/c 3T3细胞增殖活性的影响.方法重组质粒pGEX-bFGF转入到DH5α大肠杆菌体内,增菌培养表达bFGF,亲和层析纯化,制备8种不同药物浓度的bFGF,分别进行诱导Balb/c 3T3细胞增殖实验研究,MTT法检测各组细胞增殖活性.结果 bFGF诱导Balb/c 3T3细胞增殖存在浓度依赖性,最适浓度为4～16μg/L.结论 bFGF具有较好的诱导Balb/c 3T3细胞增殖的能力,为后续研究工作奠定实验基础.